抗体依存性細胞傷害レポーターバイオアッセイを用いたがん細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の評価

抗体依存性、細胞性細胞傷害性が、抗体が免疫介在性特定の効果を発揮する重要なメカニズムであることはよく知られています。そこで、ADCCSAを使用して、がん治療における抗体薬の有効性を検証するためのより良い方法を見つけたいと考えています。このプロトコルは迅速かつ簡単です。

簡単なミックスとリードプロトコルを使用することで、1日以内に結果を得ることができ、研究を迅速化することができます。ADCCバイオアッセイを用いることで、抗体医薬の大量スクリーニングをより正確に行うことができます。アッセイのS/N比は高く、治療用抗体の正確な評価に役立ちます。

まず、標的T細胞BHT101およびSW1736細胞を、T75フラスコで80%のコンフルエント度に達するまで培養する。培地を取り除いた後、細胞をPBSで一度洗浄し、1ミリリットルの非酵素的細胞解離バッファーで5分間インキュベートします。PBSを追加して反応を止めます。

細胞を135Gで5分間スピンダウンし、次に5ミリリットルのPBSを加えます。細胞数を決定し、96ウェルの白色ポリスチレンマイクロプレートにウェルあたり15, 000個の細胞で細胞を播種し、底が透明で平らです。まず、アッセイ用の標的T細胞BHT 101およびSW 1736細胞を調製します。

次に、上皮成長因子受容体に結合するセツキシマブを調製し、ネガティブコントロールとしてベバシズマブを調製します。ADCCバイオアッセイバッファーを作製するには、キットに付属の33.6ミリリットルのRPMI 1640に1.4ミリリットルの低免疫グロブリンG血清を加えます。バッファーを使用して抗体を希釈し、各抗体を3つの異なる濃度で400マイクロリットル調製します。

ADCC Bioassay Buffer を 37°C のウォーターバスで少なくとも 30 分間予熱します。ADCCバイオアッセイエフェクター細胞をマイナス80°Cの低温保存から取り出し、37°Cのウォーターバスに約2〜3分間入れます。バイアルを静かに揺らし、解凍プロセス中にバイアルを反転させずに目視検査します。

次に、630マイクロリットルのエフェクター細胞を、3.6ミリリットルのADCCSA緩衝液を含む15ミリリットルのチューブに移します。チューブを2回静かに反転させて、細胞をバッファーと混合します。まず、ADCCアッセイ用の標的細胞、エフェクター細胞、および目的の抗体を調製します。

一晩インキュベートした後、標的細胞から培地を取り出し、25マイクロリットルのADCCバイオ酸バッファーに加えて、続いて25マイクロリットルのアンタゴニストを適切なウェルに加えます。次に、ウェルあたり25マイクロリットルのADCCバイオアッセイバッファーに75,000個の欠陥細胞を、標的細胞を含む96ウェルマイクロプレートに加え、プレートを摂氏37度で6時間インキュベートします。ルシフェラーゼアッセイ試薬を調製するには、凍結乾燥ルシフェラーゼアッセイ基質にルシフェラーゼアッセイバッファーを添加します。

次に、75マイクロリットルのルシフェラーゼアッセイ試薬を、標的細胞、抗体、エフェクター細胞を含むプレートの各ウェルに加え、プレートを室温で30分間インキュベートします。ルミノメーターを使用して、各ウェルの発光シグナルを測定し、ADCC活性を定量的に読み出します。データ分析では、式を使用してフォールドインダクションを計算します。

セツキシマブは、試験したすべての濃度で高いADCC活性を誘導しましたが、ベバシズマブではBHT 101およびSW 11736のいずれの細胞株でもADCC活性は検出されず、両細胞株のEGFR細胞外膜抗原を標的とするADCC効果が示されました。