Antikora Bağımlı Hücre Aracılı Sitotoksisite Raportörü Biyotahlil Kullanılarak Kanser Hücrelerinde Antikora Bağımlı, Hücre Aracılı Sitotoksisitenin Değerlendirilmesi

Antikora bağımlı, hücre aracılı sitotoksisitenin, antikorun immün aracılı belirli etkiler gösterdiği önemli bir mekanizma olduğu iyi bilinmektedir. Bu nedenle, ADCCSA kullanarak kanser tedavisinde bir antikor ilacının etkinliğini test etmek için daha iyi bir yöntem bulmak istiyoruz. Protokol hızlı ve basittir.

Basit karıştır ve oku protokolünü kullanarak, sonucu bir gün içinde elde edebilir ve böylece araştırmayı hızlandırabiliriz. ADCC biyotahlil kullanarak, terapötik antikor ilacının toplu taramasını daha doğru bir şekilde gerçekleştirebiliriz. Testin sinyal-gürültü oranı yüksektir, bu da terapötik antikorun doğru bir şekilde değerlendirilmesine yardımcı olabilir.

Başlamak için, kültür, hedef T hücreleri BHT 101 ve SW 1736 hücrelerini, T75 şişelerinde %80'lik bir birleşime ulaşana kadar kültürleyin. Ortamı çıkardıktan sonra, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve beş dakika boyunca bir mililitre enzimatik olmayan hücre ayrışma tamponu ile inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için PBS ekleyin.

Hücreleri beş dakika boyunca 135G'de döndürün ve ardından beş mililitre PBS ekleyin. Hücre sayısını belirleyin ve hücreleri, berrak, düz bir tabana sahip 96 kuyulu, beyaz polistiren mikroplakalarda oyuk başına 15.000 hücrede tohumlayın. Başlamak için, test için hedef T hücreleri BHT 101 ve SW 1736 hücrelerini hazırlayın.

Daha sonra Cetuximab'ı epidermal büyüme faktörü reseptörüne ve Bevacizumab'ı negatif kontrol olarak bağlayın. ADCC biyotahlil tamponunu yapmak için, kitte verildiği gibi 33.6 mililitre RPMI 1640'a 1.4 mililitre düşük immünoglobulin G serumu ekleyin. Tamponu kullanarak, her bir antikorun 400 mikrolitresini üç farklı konsantrasyonda hazırlamak için antikorları seyreltin.

ADCC biyotahlil tamponunu 37 santigrat derece su banyosunda en az 30 dakika önceden ısıtın. ADCC biyotahlil efektör hücrelerini eksi 80 santigrat derece soğuk hava deposundan çıkarın ve yaklaşık iki ila üç dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna koyun. Çözdürme işlemi sırasında şişeyi ters çevirmeden nazikçe sallayın ve görsel olarak inceleyin.

Daha sonra 630 mikrolitre efektör hücreyi 3.6 mililitre ADCCSA tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri tamponla karıştırmak için tüpü iki kez yavaşça ters çevirin. Başlamak için, ADCC testi için hedef hücreleri, efektör hücreleri ve istenen antikorları hazırlayın.

Gece boyunca inkübasyondan sonra, ortamı hedef hücrelerden çıkarın ve 25 mikrolitre ADCC biyoasit tamponu ve ardından uygun kuyucuklara 25 mikrolitre antagonist ekleyin. Daha sonra, hedef hücreleri içeren 96 kuyu mikroplakasına oyuk başına 25 mikrolitre ADCC biyotahlil tamponunda 75.000 defektör hücre ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin. Lusiferaz tahlil reaktifini hazırlamak için, liyofilize lusiferaz tahlil substratına lusiferaz tahlil tamponu ekleyin.

Daha sonra, hedef hücreleri, antikor ve efektör hücreleri içeren plakanın her bir oyuğuna 75 mikrolitre lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bir luminometre kullanarak, ADCC aktivitesinin nicel bir okumasını sağlamak için her bir oyuktaki lüminesans sinyalini ölçün. Veri analizi için, formülü kullanarak katlama indüksiyonunu hesaplayın.

Cetuximab, test edilen tüm konsantrasyonlarda daha yüksek ADCC aktivitesine neden oldu, ancak BHT 101 ve SW 11736 hücre hatlarında Bevacizumab ile hiçbir ADCC aktivitesi tespit edilmedi, bu da her iki hücre hattı için EGFR hücre dışı membran antijenlerini hedeflemenin ADCC etkisini gösterdi.