항체 의존성, 세포 매개 세포 독성은 항체가 면역 매개 특정 효과를 발휘하는 중요한 메커니즘이라는 것은 잘 알려져 있습니다. 그래서 우리는 ADCCSA를 사용하여 암 치료에서 항체 약물의 효능을 테스트하는 더 나은 방법을 찾고자 합니다. 프로토콜은 빠르고 간단합니다.

간단한 mix and read 프로토콜을 사용하면 하루 이내에 결과를 얻을 수 있으므로 연구를 가속화할 수 있습니다. ADCC bioassay를 사용하여 치료용 항체 약물의 대량 스크리닝을 보다 정확하게 수행할 수 있습니다. 분석의 신호 대 잡음비가 높기 때문에 치료용 항체를 정확하게 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.

먼저 표적 T 세포 BHT 101 및 SW 1736 세포가 T75 플라스크에서 80% 포화도에 도달할 때까지 배양합니다. 배지를 제거한 후 PBS로 세포를 한 번 세척하고 1ml의 비효소 세포 해리 완충액으로 5분 동안 배양합니다. PBS를 추가하여 반응을 중지합니다.

135G에서 5분 동안 셀을 스핀다운한 다음 PBS 5ml를 추가합니다. 세포 수를 결정하고 96 well, 명확하고 편평한 바닥을 가진 백색 폴리스티렌 microplates에 있는 15, 000의 세포에 세포를 씨를 뿌린다. 먼저 분석을 위해 표적 T 세포 BHT 101 및 SW 1736 세포를 준비합니다.

그런 다음 세툭시맙(Cetuximab)을 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor)에 결합하도록 준비하고, 베바시주맙(Bevacizumab)을 음성 대조군으로 준비합니다. ADCC 생물 검정 완충액을 만들려면 키트에 제공된 33.6ml의 RPMI 1640에 1.4ml의 저면역글로불린 G 혈청을 추가합니다. 완충액을 사용하여 항체를 희석하여 각 항체 400마이크로리터를 세 가지 농도로 준비합니다.

ADCC 생물 검정 완충액을 섭씨 37도의 수조에서 최소 30분 동안 예열합니다. 영하 80도의 냉장 보관에서 ADCC 생물 검정 효과기 세포를 제거하고 약 2-3분 동안 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 해동 과정에서 바이알을 뒤집지 않고 부드럽게 흔들어 육안으로 검사합니다.

그런 다음 630마이크로리터의 이펙터 셀을 3.6ml의 ADCCSA 완충액이 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다. 튜브를 부드럽게 두 번 뒤집어 세포를 버퍼와 혼합합니다. 먼저 ADCC 분석을 위해 표적 세포, 효과기 세포 및 원하는 항체를 준비합니다.

하룻밤 배양 후 표적 세포에서 배지를 제거하고 25마이크로리터의 ADCC 바이오산 완충액과 25마이크로리터의 길항제를 적절한 웰에 추가합니다. 그런 다음 표적 세포를 포함하는 96 웰 마이크로플레이트에 웰 당 25마이크로리터의 ADCC 생물 분석 버퍼에 있는 75, 000개의 결함 세포를 추가하고 섭씨 37도에서 6시간 동안 플레이트를 인큐베이팅합니다. luciferase 분석 시약을 준비하려면 동결건조된 luciferase 분석 기질에 luciferase 분석 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 표적 세포, 항체 및 효과기 세포가 포함된 플레이트의 각 웰에 75마이크로리터의 루시퍼라제 분석 시약을 추가하고 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 광도계를 사용하여 각 웰의 발광 신호를 측정하여 ADCC 활성에 대한 정량적 판독값을 제공합니다. 데이터 분석을 위해 공식을 사용하여 폴드 유도를 계산합니다.

세툭시맙은 시험된 모든 농도에서 더 높은 ADCC 활성을 유도했지만, BHT 101 및 SW 11736 세포주에서 베바시주맙과 함께 ADCC 활성은 검출되지 않았으며, 이는 두 세포주 모두에 대해 EGFR 세포외막 항원을 표적으로 하는 ADCC 효과를 입증했습니다.