Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays

Es ist allgemein bekannt, dass die Antikörper-abhängige, zellvermittelte Zytotoxizität ein wichtiger Mechanismus ist, durch den Antikörper immunvermittelte Wirkungen ausüben. Deshalb wollen wir eine bessere Methode finden, um die Wirksamkeit eines Antikörper-Medikaments in der Krebsbehandlung zu testen, und zwar mit ADCCSA. Das Protokoll ist schnell und unkompliziert.

Durch die Verwendung eines einfachen Mix-and-Read-Protokolls können wir das Ergebnis innerhalb eines Tages erhalten und so die Forschung beschleunigen. Durch den Einsatz von ADCC-Bioassays können wir ein Massenscreening von therapeutischen Antikörpern genauer durchführen. Das Signal-Rausch-Verhältnis des Assays ist hoch, was bei der genauen Bewertung des therapeutischen Antikörpers hilfreich sein kann.

Zu Beginn kultivieren Sie die Ziel-T-Zellen BHT 101 und SW 1736 Zellen, bis sie eine Konfluenz von 80 % in T75-Kolben erreichen. Nach dem Entfernen des Mediums waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang mit einem Milliliter nicht-enzymatischem Zelldissoziationspuffer. Fügen Sie PBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen.

Schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 135 G herunter und fügen Sie dann fünf Milliliter PBS hinzu. Bestimmen Sie die Zellzahl und säen Sie die Zellen mit 15.000 Zellen pro Well in weißen 96-Well-Polystyrol-Mikroplatten mit klarem, flachem Boden aus. Bereiten Sie zunächst die Ziel-T-Zellen BHT 101 und SW 1736 Zellen für den Assay vor.

Bereiten Sie dann Cetuximab so vor, dass es an den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor bindet, und Bevacizumab als Negativkontrolle. Für die Herstellung des ADCC-Bioassay-Puffers fügen Sie 1,4 Milliliter Serum mit niedrigem Immunglobulin-G-Gehalt in 33,6 Milliliter RPMI 1640 hinzu, wie im Kit enthalten. Verdünnen Sie die Antikörper mit dem Puffer, um 400 Mikroliter jedes Antikörpers in drei verschiedenen Konzentrationen herzustellen.

Erhitzen Sie den ADCC-Bioassay-Puffer in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für mindestens 30 Minuten. Nehmen Sie die ADCC-Bioassay-Effektorzellen aus dem Kühlhaus bei minus 80 Grad Celsius und legen Sie sie für etwa zwei bis drei Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Schütteln Sie das Fläschchen vorsichtig und inspizieren Sie es visuell, ohne es während des Auftauvorgangs umzudrehen.

Übertragen Sie dann 630 Mikroliter Effektorzellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das 3,6 Milliliter ADCCSA-Puffer enthält. Drehen Sie das Röhrchen zweimal vorsichtig um, um die Zellen mit dem Puffer zu mischen. Bereiten Sie zunächst die Zielzellen, Effektorzellen und die gewünschten Antikörper für den ADCC-Assay vor.

Nach der Inkubation über Nacht entfernen Sie das Medium aus den Zielzellen und fügen Sie 25 Mikroliter ADCC-Biosäurepuffer hinzu, gefolgt von 25 Mikrolitern Antagonisten in geeignete Vertiefungen. Geben Sie dann 75.000 defekte Zellen in 25 Mikrolitern ADCC-Bioassay-Puffer pro Vertiefung in die 96-Well-Mikroplatte mit den Zielzellen und inkubieren Sie die Platte sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Um das Luciferase-Assay-Reagenz vorzubereiten, fügen Sie dem lyophilisierten Luciferase-Assay-Substrat Luciferase-Assay-Puffer hinzu.

Geben Sie dann 75 Mikroliter des Luciferase-Assay-Reagenzes in jede Vertiefung der Platte, die Zielzellen, Antikörper- und Effektorzellen enthält, und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Messen Sie mit einem Luminometer das Lumineszenzsignal in jeder Vertiefung, um eine quantitative Anzeige der ADCC-Aktivität zu erhalten. Berechnen Sie für die Datenanalyse die Falteninduktion mit der Formel.

Cetuximab induzierte bei allen getesteten Konzentrationen eine höhere ADCC-Aktivität, aber es wurde keine ADCC-Aktivität mit Bevacizumab in den Zelllinien BHT 101 und SW 11736 nachgewiesen, was den ADCC-Effekt der Ausrichtung auf extrazelluläre EGFR-Membranantigene für beide Zelllinien zeigt.