Оценка антителозависимой, клеточно-опосредованной цитотоксичности в раковых клетках с помощью антителозависимого клеточно-опосредованного репортерного биоанализа

Хорошо известно, что антителозависимая, клеточно-опосредованная цитотоксичность является важным механизмом, с помощью которого антитела оказывают определенные иммуноопосредованные определенные эффекты. Поэтому мы хотим найти лучший метод проверки эффективности антител в лечении рака с помощью ADCCSA. Протокол быстр и прост.

Используя простой протокол смешивания и чтения, мы можем получить результат в течение одного дня, тем самым ускоряя исследование. Используя биоанализ ADCC, мы можем более точно проводить массовый скрининг терапевтических антител. Соотношение сигнал/шум анализа высокое, что может помочь в точной оценке терапевтического антитела.

Для начала культивируйте целевые Т-клетки BHT 101 и SW 1736 до тех пор, пока они не достигнут 80% конфлюенции в колбах T75. После удаления среды один раз промойте клетки PBS и инкубируйте их с одним миллилитром буфера для диссоциации неферментативных клеток в течение пяти минут. Добавьте PBS, чтобы остановить реакцию.

Раскрутите ячейки при 135G в течение пяти минут, а затем добавьте пять миллилитров PBS. Определите количество клеток и засейте клетки по 15 000 клеток на лунку в 96 луночных белых полистирольных микропланшетах с прозрачным плоским дном. Для начала подготовьте целевые Т-клетки BHT 101 и клетки SW 1736 для анализа.

Затем готовят Цетуксимаб для связывания с рецептором эпидермального фактора роста, а Бевацизумаб в качестве отрицательного контроля. Для изготовления буфера для биоанализа ADCC добавьте 1,4 миллилитра сыворотки с низким содержанием иммуноглобулина G в 33,6 миллилитра RPMI 1640, как входит в комплект. Используя буфер, разбавьте антитела для получения 400 микролитров каждого антитела в трех различных концентрациях.

Разогрейте буфер для биопроб ADCC на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 30 минут. Извлеките эффекторные клетки биопробы ADCC из холодильника при температуре минус 80 градусов Цельсия и поместите их на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия примерно на две-три минуты. Аккуратно покачивайте и визуально осматривайте флакон, не переворачивая его в процессе размораживания.

Затем перенесите 630 микролитров эффекторных клеток в 15-миллилитровую пробирку, содержащую 3,6 миллилитров буфера ADCCSA. Аккуратно переверните трубку дважды, чтобы смешать клетки с буфером. Для начала подготовьте клетки-мишени, эффекторные клетки и желаемые антитела для анализа ADCC.

После ночной инкубации удалите среду из клеток-мишеней и добавьте 25 микролитров буфера биокислот ADCC, а затем 25 микролитров антагонистов в соответствующие лунки. Затем добавьте 75 000 клеток-дефекторов в 25 микролитров биопробного буфера ADCC на лунку в 96-луночный микропланшет, содержащий клетки-мишени, и инкубируйте планшет в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия. Для приготовления реагента для анализа люциферазы добавьте буфер для анализа люциферазы в субстрат для анализа лиофилизированной люциферазы.

Затем добавьте 75 микролитров реагента для анализа люциферазы в каждую лунку планшета, содержащую клетки-мишени, антитела и эффекторные клетки, и инкубируйте планшет в течение 30 минут при комнатной температуре. С помощью люминометра измерьте сигнал люминесценции в каждой лунке, чтобы получить количественное считывание активности ADCC. Для анализа данных рассчитайте индукцию сгибания по формуле.

Цетуксимаб индуцировал более высокую активность ADCC во всех исследуемых концентрациях, но активность ADCC не была обнаружена при использовании бевацизумаба ни в клеточных линиях BHT 101, ни в SW 11736, что демонстрирует эффект ADCC при нацеливании на антигены внеклеточных мембран EGFR для обеих клеточных линий.