Portanto, nossa pesquisa diz respeito às adaptações bacterianas à limitação do zinco que vão além da conservação do zinco. Então, usamos as bactérias patogênicas, Mycobacterium tuberculosis, e as não patogênicas, Mycobacterium smegmatis, para ver como a limitação do zinco afeta coisas como fisiologia bacteriana e patogênese. Outra coisa em que estamos interessados são as proteínas ribossômicas alternativas, que são expressas por muitas bactérias durante a limitação do zinco, mas ainda não sabemos muito sobre elas.
Tanto as micobactérias patogênicas quanto as não patogênicas mostraram respostas dramáticas à limitação do zinco com níveis de expressão em centenas de genes e proteínas influenciados pela disponibilidade do micronutriente zinco. Fisiologicamente, isso resulta em uma morfogênese profunda para Mycobacterium smegmatis e uma resposta ao estresse oxidativo significativamente regulada em Mycobacterium smegmatis e Mycobacterium tuberculosis patogênico. Este protocolo aborda a dificuldade de reprodução e padronização das condições para o crescimento limitante do zinco na produção de ribossomos alternativos translacionalmente ativos em micobactérias.
Observamos fatores fora de nosso controle, como um evento de chuva forte, correlacionando-se com contaminação por zinco e preparação de meios limitados por zinco. O fenótipo bioindicador apresentado aqui garante a reprodutibilidade dos resultados de crescimento limitantes do zinco. O fenótipo bioindicador quantificável descrito aqui permite alcançar condições limitantes de zinco sem o uso de agentes quelantes.
Portanto, permite a produção padronizada de ribossomos alternativos translacionalmente ativos e aplicações a jusante, como macrófagos ou infecções animais, para estudar as interações patógeno-hospedeiro. Portanto, nosso laboratório está trabalhando para entender as funções específicas de cada proteína ribossômica alternativa e como a incorporação dessas proteínas nos ribossomos pode afetar a tradução. E também estamos tentando ver se os resultados que vemos em M.smegmatis também podem ser aplicados ao MTB e se podem ser usados para desenvolver melhores tratamentos para TB.
Para começar, adicione cinco mililitros de meio 7H9-ADC a um tubo de biorreator de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 microlitros de células estoque de glicerol descongeladas de Mycobacterium smegmatis e enrosque a tampa no tubo. Posicione o tubo firmemente em um ângulo de aproximadamente 45 graus e incube a 37 graus Celsius com 120 rpm por 18 horas.
Após a incubação, meça a densidade óptica em 600 nanômetros e confirme se está em torno de 0,5 a 0,8. Centrifugar a cultura a 3000 x g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio limitado de zinco, ou ZLM.
Durante a centrifugação, esterilize uma cubeta enchendo-a com etanol a 70% até transbordar e deixe-a descansar por 10 minutos. Em seguida, enxágue a cubeta três vezes com ZLM. Após a centrifugação final, ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de ZLM.
Anular o espectrofotómetro utilizando 600 microlitros de ZLM numa cubeta. Transfira 600 microlitros de células lavadas para a cubeta esterilizada e meça a absorbância em 600 nanômetros. Se a densidade óptica estiver acima de um, use a fórmula fornecida.
Para calcular o volume de ZLM a ser adicionado aos 600 microlitros de células lavadas na cubeta para obter uma densidade óptica de um, adicione o volume calculado de ZLM à cubeta. Misture bem pipetando cinco a 10 vezes e meça novamente a absorbância. Em seguida, adicione 50 mililitros de ZLM no frasco Erlenmeyer de plástico estéril e autoclavado de 250 mililitros.
Inocular os frascos adicionando 50 microlitros da cultura ajustada a uma densidade óptica de um da cubeta. Para meios repletos de zinco, adicione 30 microlitros de sulfato de zinco 10 milimolares para atingir uma concentração final de seis micromolares. Incubar a cultura a 37 graus Celsius com agitação de 100 rpm por três dias para atingir a fase estacionária.
A cada dia de crescimento, adicione 200 microlitros de cultura em uma microplaca de fundo plano de 96 poços e meça as métricas de crescimento em um leitor de microplacas monocromador. Para relatar a densidade celular obtida de um leitor de microplacas, gere uma curva padrão para converter a leitura do comprimento do caminho usando um volume definido para o comprimento de caminho padrão de um centímetro. Defina o comprimento de onda de excitação para 420 nanômetros e a emissão em 475 nanômetros para medir a fluorescência do cofator F420.
Em seguida, defina o comprimento de onda de excitação para 375 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 475 nanômetros para medir a fluorescência de fundo. Gere uma varredura de intensidade de fluorescência de excitação de 230 nanômetros a 440 nanômetros em etapas de cinco nanômetros, com emissão fixa em 475 nanômetros. Usando a equação a seguir, calcule a porcentagem de intensidade de fluorescência de 375 nanômetros a 420 nanômetros.
Após três dias, para registrar o comprimento da célula, limpe uma lâmina de vidro e uma lamínula com um pano sem fiapos. Pipete uma gota de 10 microlitros de cultura na lâmina e coloque a lamínula. Pressione suavemente a lamínula para que a cultura se espalhe para preencher quase toda a área por baixo.
Usando um microscópio composto com imersão em óleo 100X e objetivas oculares 10X Com o acessório da câmera, visualize a lâmina preparada. Tire fotos de áreas com várias células que estão em foco no plano e não se movem. Usando o mesmo microscópio e objetiva, crie uma imagem de uma lâmina de calibração.
No software Fiji, selecione a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha ao longo do comprimento da lâmina de calibração. Selecione Analisar, seguido de Definir escala e insira a distância conhecida em unidade para a barra de escala. Em seguida, selecione global para aplicar a escala a todas as imagens e medições.
Agora abra a imagem e use a ferramenta de linha reta para desenhar uma linha ao longo do comprimento da célula para medi-la. Copie os dados de comprimento da célula da janela pop-up para uma planilha ou salve-os como um arquivo de valores separados por vírgula para análise estatística. As culturas selvagens cultivadas em ZLM apresentaram valores de densidade óptica mais baixos em comparação com os meios repletos de zinco, com cepas delta altRP tendo valores ainda mais baixos.
O alongamento celular foi observado em culturas do tipo selvagem ZLM com um comprimento celular médio de nove micrômetros, enquanto as células repletas de zinco foram mais curtas em torno de três micrômetros. As células delta altRP não mostraram alongamento significativo em condições limitadas ao zinco. As varreduras de fluorescência mostraram diminuição da fluorescência do cofator F420 em culturas de tipo selvagem ZLM, com cepas delta altRP mostrando variabilidade de fluorescência muito maior.
