O escopo de nossa pesquisa é desenvolver um novo método in vitro para a avaliação rápida e sensível da toxicidade e ecotoxicidade de poluentes com base na avaliação da motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis como organismo modelo. Métodos baseados em efeitos, como bioensaios in vitro e in vivo, representam ferramentas inovadoras para detectar os efeitos de poluentes químicos ambientais em organismos vivos. Esses métodos podem servir como ferramentas no biomonitoramento ambiental e na avaliação de riscos.
Esta pesquisa aborda uma lacuna significativa na toxicologia, concentrando-se no uso da motilidade dos hemócitos como novo ponto final para avaliar o efeito dos poluentes nos mexilhões. Embora a motilidade dos hemócitos seja crucial para as respostas imunes, sua sensibilidade à exposição a poluentes é pouco estudada em bivalves. Nossa descoberta avança a pesquisa em toxicologia e ecotoxicologia de várias maneiras.
Oferecendo um novo ponto final para triagem de toxicidade, apoiando a pesquisa ética, minimizando os testes de vertebrados e avançando na aplicabilidade em ecotoxicologia. Essa abordagem pode ter uma ampla aplicação no biomonitoramento ambiental e pode ser adaptada para outras células imunes em ecotoxicologia. Para começar, pré-encha uma seringa com 0,5 mililitros de solução salina fisiológica padrão temperada a 15 graus Celsius.
Posicione o espécime de mexilhão adulto aclimatado para a coleta de hemolinfa. Usando um bisturi, separe leve e cuidadosamente as válvulas ao longo da superfície ventral. Mantenha o bisturi na posição ou use uma ponta de pipeta para manter o espaço aberto.
Em seguida, insira a agulha de uma seringa hipodérmica no espaço entre as válvulas. Colete suavemente 0,5 mililitros de hemolinfa do músculo adutor posterior usando a seringa pré-cheia. Agora, retire a agulha da seringa e transfira o conteúdo da seringa para um microtubo.
Agrupar as amostras colhidas de três a quatro mexilhões num tubo que mantenha a temperatura de 15 graus Celsius. Após avaliar a viabilidade dos hemócitos, para cultivá-los, adicione 50 microlitros de hemolinfa diluída nos poços de uma microplaca de 96 poços, de fundo plano, de poliestireno e tratada com TC e cubra a placa com sua tampa. Deixe os hemócitos aderirem ao fundo dos poços por 30 minutos a 15 graus Celsius para formar uma monocamada.
Em seguida, usando uma micropipeta, aspire suavemente o excesso de hemolinfa dos poços. Para realizar ensaios de curto prazo dentro de uma a quatro horas, adicione imediatamente 100 microlitros da substância de interesse dissolvida em solução salina fisiológica. Para exposições prolongadas de 24 a 48 horas, incubar as células aderentes cultivadas com a substância de ensaio dissolvida no meio de cultura suplementado a 15 graus Celsius.
Para começar, obtenha os hemócitos cultivados tratados com a substância de interesse. Para melhorar a visualização dos hemócitos, remova o meio de incubação de cada poço e comine as células com 100 microlitros de solução de coloração de corante vital vermelho neutro antes da microscopia de lapso de tempo. Incube as células a 15 graus Celsius em uma câmara climática por 15 minutos.
Após a incubação, lave o excesso de corante e adicione 100 microlitros da substância de interesse dissolvida em solução salina fisiológica padrão. Insira a placa de vários poços contendo as células tratadas em um leitor multimodo. Realize imagens em tempo real na placa por meio de microscopia de lapso de tempo com ampliação de 20X e visualização de campo claro.
Para rastreamento de células e cálculo de parâmetros velocimétricos, obtenha os quadros individuais usando o software Gen5 e salve as imagens em uma pasta sem espaços no nome. Em ImageJ, navegue até Arquivo, seguido de Importar e Sequência de imagens. Execute o rastreamento de células em células únicas usando o plug-in de rastreamento manual.
Importe conjuntos de dados do plug-in de rastreamento manual ImageJ para o software Chemotaxis and Migration Tool. Selecione o número desejado de fatias para rastreamento. Calibre o software com as configurações de tamanho de pixel X/Y e intervalo de tempo.
Depois de definir os parâmetros, clique em Aplicar configurações. Plote trajetórias e exporte como uma imagem. Clique no botão Valores medidos para view os resultados e salve os dados.
Em seguida, clique no botão Estatísticas e salve os dados de velocidade e direção para a série de pistas. Comparar os parâmetros velocimétricos calculados das células de controlo com os dos hemócitos expostos à substância em estudo em concentrações variáveis. A motilidade dos hemócitos foi avaliada usando imagens de lapso de tempo, mostrando movimentos celulares individuais ao longo de 10 minutos, com rastreamento consistente de células numeradas em três pontos de tempo de zero, cinco e 10 minutos.
Dois morfotipos de hemócitos, células espalhadas e células redondas menores em forma de estrela, foram observados. Ambos os tipos apresentaram mudanças contínuas de forma devido à atividade de lamelipódios e pseudópodes. Os gráficos de velocidade e franqueza indicaram que, em condições fisiológicas basais, as células espalhadas se moviam mais rapidamente em comparação com células menores.
A exposição ao paracetamol reduziu significativamente a motilidade das células disseminadas após 24 horas, enquanto as células pequenas não apresentaram tal redução. A franqueza das células pequenas aumentou significativamente após 24 horas de exposição ao paracetamol, enquanto as células espalhadas mostraram diminuição da franqueza após apenas uma hora.
