Este método aborda como analisar processos de desenvolvimento, como contrações musculares e rolamentos que ocorrem no embrião Drosophila. Algumas vantagens dessa técnica são que ela é não invasiva e bastante detalhada, mas é relativamente simples de realizar. Nosso método pode ser desenvolvido ainda mais para triagem baseada em análise de alto conteúdo para isolar e analisar novas mutações que afetam contrações musculares embrionárias e outros processos de desenvolvimento.
Ao visualizar contrações musculares, é importante cronometrar adequadamente as coletas de embriões porque as contrações começam apenas em um estágio específico de desenvolvimento. A demonstração visual passo a passo pode ajudar muito na análise quantitativa dos processos de desenvolvimento. Para imagens ao vivo de embriões de Drosophila montados, coloque os embriões no estágio de um microscópio de epifluorescência com uma função timelapse e uma câmera digital com filtros de emissão adequados e selecione uma lente objetiva de imersão de água de 10X.
Em seguida, o vídeo ao vivo grava os embriões usando o software de gravação de microscópio apropriado por cerca de uma a duas horas com uma taxa de aquisição de quatro quadros por segundo. No final do experimento, exporte o vídeo gravado diretamente para ImageJ. Selecione imagem e cultura para desenhar uma caixa em torno de cada embrião individual para cortar as gravações de vídeo para o tamanho de cada embrião.
Clique em Imagem, Transforme e Gire para girar as imagens cortadas para alcançar uma posição vertical do embrião midline em relação à tela. Para definir medições de distância para micrômetros, clique em Analisar e Definir escala, em seguida, digite o fator de conversão de proporção pixel para micn conhecido para a configuração do microscópio. Todas as medições subsequentes serão então relatadas em micrômetros.
Para analisar o embrião rolando, primeiro marque a posição de uma ou ambas traqueias de um embrião no primeiro quadro do vídeo no meio do caminho entre as extremidades posterior e anterior e clique em Analisar, Ferramentas e Região de Interesse Manager. Desenhe um aproximadamente sete micrômetros por caixa de sete micrômetros ao redor da traqueia e clique na tecla T no teclado para gravar esta posição como uma coordenada XY. Marque a posição da mesma área da traqueia após contrações peristálticas de interesse e desenhe uma linha conectando os centros de cada caixa clicando M no teclado para medir a distância da posição de pré-contração à posição pós-contração.
Para analisar contrações musculares embrionárias usando embriões expressando marcadores musculares fluorescentes, use o registro da leitura fluorescente para desenhar uma região de interesse centrada em torno dos músculos fluorescentes de um determinado segmento corporal de interesse. Selecione a guia Adicionar T no Gerenciador de Região de Interesse para registrar a posição da região de interesse. Clique em Gerente de Região de Interesse e Medida para registrar a intensidade fluorescente média de cada região de interesse selecionada para cada quadro do vídeo.
Mova a caixa para os centros de outros segmentos de interesse do corpo e clique em Adicionar T para registrar suas posições para obter regiões de interesse de tamanho idêntico em todos os segmentos corporais a serem analisados. Na Região de Controle gerente, detém a chave Controle enquanto seleciona todas as regiões de interesse registradas como coordenadas XY. Clique em Mais e Multi-Medida para medir a intensidade fluorescente média de cada região de interesse para todos os quadros do vídeo.
Isso relatará cada medição em uma tabela com cada região de interesse como uma coluna da tabela e cada quadro como uma linha. Em seguida, transfira a tabela para um programa de planilha para análise posterior. Plote um gráfico com o número do quadro no eixo x e a intensidade média de fluorescência no eixo y e converta o número do quadro em tempo usando a taxa de quatro quadros por segundo.
As contrações musculares aumentam a intensidade do GFP à medida que trazem mais GFP para as proximidades da área focal à medida que mais músculos são puxados durante essas contrações. Para determinar a amplitude da contração muscular, estime a intensidade de GFP de base como a intensidade média das regiões entre os picos. Em seguida, avalie o aumento da intensidade de fluorescência do GFP em relação a esta linha de base.
Em seguida, divida cada região de valor de intensidade de juros pela intensidade da linha de base para normalizar a intensidade do GFP para a linha de base. Compare as intensidades normalizadas de GFP nos segmentos posterior, medial e anterior durante a onda de contração muscular para examinar as mudanças na extensão da contração muscular à medida que a onda se propaga e determinar a direção da onda. Para comparar as contrações musculares nos lados esquerdo e direito do embrião, analise as intensidades máximas para os mesmos segmentos em ambos os lados do embrião.
Use a amplitude de contração e o tempo dos picos para revelar as diferenças, se houver, e a extensão e o tempo das ondas de contração muscular peristáltica. Aqui são mostradas contrações musculares peristálticas normais em um embrião de Drosophila tipo selvagem. Neste vídeo de rolamento em um embrião tipo selvagem, note que o apêndice dorsal não se move enquanto a traqueia indica que o embrião rolou dentro de sua concha.
Nesta análise representativa, os picos de contração muscular durante o período de tempo de 165 a 178 segundos representam uma única onda para a frente. Para este embrião, não houve diferença na amplitude e o tempo das contrações musculares foi medido nos lados direito e esquerdo do embrião. Uma contração peristáltica é designada como uma onda de frente tipo um se seu perfil tiver um pico que surge na região posterior primeiro seguido por picos nas regiões média e anterior.
Uma onda de tipo um para trás é um pico que surge primeiro em segmentos anteriores e, em seguida, se propaga em direção a regiões posteriores. As ondas tipo dois começam em uma extremidade do embrião e seguem em direção às regiões médias antes de retornar à sua origem como uma onda de varredura reiniciada na extremidade oposta. Os embriões mutantes de postura corporal demonstram uma frequência relativa anormal do tipo um à geração de ondas tipo dois que resulta em uma anormalidade de postura corporal designada como o fenótipo de torção corporal ou rotação.
Para usar a fluorescência como leitura para os parâmetros de contração muscular, é essencial usar embriões com um repórter no tecido muscular. Este método pode ser utilizado para o registro simultâneo das contrações musculares de muitos embriões e para a avaliação das respostas a diversos estímulos, drogas ou alterações ambientais.
