Количественный анализ хроматина протеомов в болезнь

Резюме

Достижения в области масс-спектрометрии позволило высокой пропускной анализ экспрессии белка и изменения в целый ряд тканей. В сочетании с субклеточных фракционирования и болезни модели, количественные масс-спектрометрии и биоинформатика может выявить новые свойства в биологических системах. Метод, описанный здесь анализ хроматин-ассоциированных белков в условиях болезни сердца и легко применим и к другим В естественных условиях Моделей человеческих заболеваний.

Аннотация

В ядре находятся протеомов, функции которых наиболее тесно связана с генной регуляции. Взрослых млекопитающих ядер кардиомиоцитов являются уникальными в связи с высоким процентом двуядерных клеток, ¹ преимущественно гетерохроматиновых состояния ДНК, и без деления характера кардиомиоцитов взрослого, который оказывает ядер в постоянном состоянии интерфазы ^2. Регуляция транскрипции в процессе разработки и Болезнь была хорошо изучена в этом органе, ^3-5, а то, что остается относительно неисследованной является роль, которую играют ядерные белки, отвечающие за упаковку ДНК и экспрессии, и как эти белки контролировать изменения в транскрипционной программы, которые происходят во время болезни. ⁶ В развитых мира, болезнь сердца является причиной номер один смертности для мужчин, так и женщин. ⁷ Insight о том, как ядерные белки сотрудничать регулировать прогрессирование этого заболевания имеет решающее значение для продвижения современного лечения Options.

Масс-спектрометрия является идеальным инструментом для решения этих вопросов, поскольку оно позволяет объективно аннотации ядерного протеома и относительное количественное о том, как обилие этих белков изменяется с болезнью. Хотя было несколько протеомных исследований для млекопитающих ядерные белковые комплексы, ^8-13 до недавнего времени ¹⁴ было только одно исследование изучения сердечных ядерной протеома, и это считается всего ядра, а не изучения протеома на уровне отсеков АПЛ ^15. В значительной степени этот недостаток работы связано с трудностью выделения сердечной ядер. Сердечная ядер происходит в жесткой и плотной актин-миозин аппарат, к которому они подключены через несколько расширений эндоплазматической сети, в той степени, миоцитов изменяет сокращение их общей форме ^16. Кроме того, кардиомиоцитов на 40% митохондрий по объему ^17, который necessitaTES обогащения ядро ​​отдельно от других органелл. Здесь мы опишем протокол для сердечной обогащению урана и дальнейшего фракционирования в биологически соответствующие отсеки. Кроме того, мы подробно методы этикетки без количественного масс-спектрометрического рассечение этих фракций, методы поддаются в естественных условиях эксперименты в различных животных моделях и систем органов, где метаболические маркировке не представляется возможным.

протокол

Экспериментальные рабочий процесс содержит семь основных этапов (рис. 1). Для любых работ, связанных с образцами, которые будут работать на масс-спектрометре, экспериментатор должен носить халат, перчатки и волосы чистые и заботиться, чтобы избежать загрязнения от пыли и личных пролития кератина.

1. Усреднение сердца и ядерной изоляции

Мышь сердца гомогенизируют и нетронутой ядер гранул выделяется (рис. 2).

1. Жертва взрослой мыши, акцизы сердце, промыть в ледяной PBS, и гомогенизируют на льду в стеклянной Dounce (мы предпочитаем Grinder Wheaton Ткань из Фишера, № 08-414-13A, но и другие методы могут одинаково хорошо работать), содержащий 2 мл буфера для лизиса (гипотонический раствор, который дифференциально лизирует клеточных мембран органелл над включая ядро) (10 мМ Трис, рН 7,5, 15 мМ NaCl и 0,15% об / об Nonidet P-40 [NP-40] в деионизированной воде плюс протеазы, фосфатазы и яnhibitor смесь: 10 мМ бутират натрия, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида [PMSF], 0,2 мМ Na ₃ VO _4, 0,1 мМ NaF и 1 Roche протеазы pellet/10 мл - лизис буфера может храниться до одной недели при -20 ° C ). (Примечание: мы не считаем необходимым заливать сердца PBS, так как наши данные масс-спектрометрии и GO анализа идентифицировать белки, преимущественно кардиомиоцитов [р-значение 3.8E-22] по происхождению, в отличие от крови загрязнений [стр. значения 5,0 E-2]).
2. Залить лизата через 100 мкм сито и собирают потока через трубку в 1,5 центрифуги мл. На данный момент, если не указано, образцы должны храниться на льду.
3. Центрифуга при 4000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C.
4. Удалить супернатант. (Это цитозоле, и должны храниться при температуре -80 ° C. Он содержит лизированных митохондрий.) Ресуспендируют осадок в 200 мкл буфера для лизиса путем растирания. (Это примитивное ядерное гранул).
5. Заполните 1,5 мл центрифужные пробирки с 1 мл сахарозы баффэр (24% веса сахарозы / объем, 10 мМ Трис, рН 7,5, и 15 мМ NaCl в деионизированной воде с протеазы / ингибиторы фосфатазы смеси - сахароза буфер должен быть свежим в тот день использования). Аккуратно слой Ресуспендированный осадок на верхней площадке сахарозы и центрифуге при 5000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C.
6. Удалить тонкую пленку на верхней, так и сахарозы площадки (которые содержат мембраны). Промойте оставшиеся гранулы с 200 мкл ледяной PBS / EDTA (1x PBS с 1 мМ EDTA). (Это ядер гранул и могут быть растворены или фиксированный для использования в вестерн-блоттинга или электронной микроскопии [См. шаги 4.1 и 4.2] для количественного обогащения.)

2. Нуклеоплазму и моющих средств экстрагируют хроматина Фракционирование

Сырой ядра гранулы разделены на нуклеоплазму и моющих средств экстрагируют хроматина фракции, содержащие белки слабо связаны с ДНК.

1. Осадок растирают с шагом 1,6 в 200 мкл буфера для экстракции моющих средств (20 мМ HEPES рН 7,6, 7,5 мМ MgCl _2. 0,2 мМ ЭДТА, 30 мМ NaCl, 1 М мочевины, 1% NP-40 в деионизированной воде с протеазы / ингибиторы фосфатазы смеси - буфер моющим средством извлечения может храниться до одной недели при температуре -20 ° C).
2. Vortex образца в 2 раза, 10 сек каждый. Место на льду 10 мин.
3. Центрифуга при 13000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C.
4. Удалить супернатант. (Это нуклеоплазму и должны храниться при температуре -80 ° C). Промойте осадок ледяной PBS / EDTA. (Это хроматина гранул).
5. Растирают осадок в 300 мкл Трис, SDS, ЭДТА буфере (50 мМ Трис, рН 7,4, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS в деионизированной воде с протеазы / ингибиторы фосфатазы смеси - Трис, SDS, ЭДТА буфере может храниться до одной недели -20 ° C).
6. Разрушать ультразвуком 3-6 раза в течение 10 секунд каждый, чтобы разбить ДНК. Храните образцы на льду между sonications.
7. Центрифуга при 13000 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C. Держите супернатант. (Супернатант моющего средства экстракты белка хроматина fractioп и должны храниться при температуре -80 ° C). Оставшийся осадок должна быть небольшой и может быть отброшено.
8. При использовании изолированного миоцитов, а не от всего сердца: Изоляция новорожденных миоциты желудочка крысы из крысят один день после рождения использованием ферментативного расщепления, затем культуру в Дульбекко изменения Eagle среде (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% инсулина -трансферрин-селенит натрия (СТС), и 1% пенициллина. Через 24 часа, трансфер в сыворотке свободных средств массовой информации (такой же, как и выше, но не хватает FBS). Урожай клеток в буфере для лизиса (перечисленных в 1,1), и начать ядерную фракционирования на шаге 1.3.

3. Acid-экстракция Фракционирование - ДНК-связанных обогащения белком

Отдельные обогащает фракционирования белков тесно связан с ДНК, в том числе гистонов.

1. Повторите шаги 1.1-2.4.
2. Растирают хроматина осадок в 400 мкл 0,4 N серной кислоты. Vortex, чтобы удалить сгустки.
3. Инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин или overnРАВО при вращении.
4. Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для удаления ядерным мусором.
5. Передача супернатант в новую пробирку.
6. Добавить 132 мкл трихлоруксусной кислоты по каплям к супернатант. Обратить несколько раз. Инкубировать на льду в течение 30 мин.
7. Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
8. Удалите супернатант. Аккуратно промойте осадок ледяной ацетон. (Это гистонов гранул).
9. Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
10. Повторите мыть, шаг 3,8-3,9.
11. Air-сухих гранул.
12. Ресуспендируют осадок в 100 мкл Трис, SDS, EDTA буфер. Установить рН до 8 путем добавления 1 М Трис. (Используйте 1 М Трис акций, которые не рН с поправкой).
13. Разрушать ультразвуком в водяной бане в течение 15 мин. Предотвращение перегрева путем добавления льда в воду ванны. (Это кислотно-извлеченного фракции и должны храниться при температуре -80 ° С)

4. Проверить чистоту

Западные кляксы и электронной микроскопииподтвердить успешное обогащение ядер и истощение других органелл. Чтобы увидеть типичные результаты для всех следующих тестов контроля качества, пожалуйста, см. нашу предыдущую публикацию ^18.

1. Выполните Вестерн-блоттинга. Зонд мембраной, содержащей каждой фракции для гистона H2A или nucleoporin p62 (как ядерные маркеры для проверки обогащение), и для аденина нуклеотидных транспортер, BiP и тубулина (как митохондриальных маркеров, эндоплазматический ретикулум маркером, и цитоскелета маркера соответственно для проверки чистоты). Чтобы убедиться в успешном subfractionation ядер, зонд для гистона H3 или фибрилларин (моющие средства и кислоты, экстракты хроматина и нетронутой ядер) и SNRP70 или E2F (нуклеоплазму). Зонд для ретинобластомы или гипоксии индуцируемый фактор-1 (обогащенный моющее средство экстракции хроматина за кислотно-извлеченного фракции). Дополнительные образцы контроля HeLa лизат клеток и целого лизат сердца также может быть запущен в том же геле: Подготовка HeLa клеточный лизат контроль, добавляя Tris, SDS, EDTA буфера блюдо культуры и с помощью мобильного скребок для сбора образцов. Разрушать ультразвуком и центрифугируют образца, как в шагах 2.6-2.7. Подготовить весь контроль лизат сердце гомогенизации сердца в 2 мл буфера (20 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1% тритона Х-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ глицерофосфата в деионизированной воде протеазы и смеси ингибиторов фосфатазы). Разрушать ультразвуком и центрифугируют, как в шагах 2.6-2.7. См. шаг 5 для подготовки образцов белка для SDS-PAGE.
2. Электронная микроскопия: Ресуспендируют ядра гранулы с шагом 1,6 в буфере для лизиса, содержащего 2% gluteraldehyde и исправить образца при 4 ° C. Промыть образцов в осмиевой кислоты, обезвоживают, и вставлять в эпоксидной смоле. Вырезать 70 нм срезов при использовании Reichert Ultracut ультрамикротомом. Пятно образцов в уранилацетатом, а затем свинца и изображения, используя JEOL 100CX просвечивающего электронного микроскопа. Количественная обогащения измерения площади нетронутой ядер по сравнению с общей площадью материал образа. Мы находим 60-80% ядернеповрежденными ^14.

Важные соображения по обогащению сравнению с очисткой ядра. Данный протокол был разработан для протеомных анализа сердечного хроматина с целью изучения глобальных процессов регуляции генов во время болезни. Одним из основных компонентов разработки целого протеома экспериментов масс-спектрометрии является вопрос о динамическом диапазоне и быть в состоянии идентифицировать и охарактеризовать низкой обилие белков. В дополнение к основной целью предоставления информации по ядерной и хроматина конкретных биологии, обогащая для ядерных протеома, увеличивает вероятность обнаружения этих низких изобилие белков, так же как и дальнейшее subfractionation ядер. Однако, как уже говорилось, взрослых кардиомиоцитов имеет плотную цитоскелета компонента, подключенного к ядерной мембране. Мы не считаем, что мы полностью очищенного ядра от этих других клеточных компонентов. Тем не менее, обогащая только для ядер, у нас есть получитьред приемлемый порог для того, чтобы виды анализов описаны.

В частности, мы использовали EM оценить чистоту нашего сырья ядра гранулы и обнаружил, 60-80% доли в неповрежденными ядер, примерно на 10% митохондрий, а остальное мусор. Кроме того, мы знаем из нашего предыдущего исследования на интактной населения ядер, что, хотя многие миофиламентов не обогащенные этим протоколом (в том числе тубулина и актина, как измеряется западных) определенных белков (calsarcin-1) обогащаются, предлагая истинный биологический населения этих белков в сердечной ядер ^19.

Кроме того, мы сравнили белки мы обнаружили, чтобы быть в кислотно-извлеченного хроматина фракции, к прогнозируемой роли этих белков ген онтологии. Важно отметить, что этот анализ генов онтология не принимать во внимание относительное содержание различных белков (так же как и наши западные данным блот), а подсчитывает все белка идентифицирован (обогатитьред или нет) как равных при определении общих путей и клеточных отсеках. Анализ этих путей и клеточных отсеках можно найти в наших предыдущих публикациях. ^18,20 Самое главное, что успех обогащения в кислотно-извлеченные фракции хроматина позволил нам выявить наличие 54 вариантов гистонов у взрослых кардиомиоцитов мышей, ¹⁸ многие из которых опирается на один уникальный пептид для идентификации, и, таким образом, вероятно, не были обнаруживаются без этого обогащения протокола, учитывая огромные сложности всего протеома кардиомиоцитов. Из 1048 мы идентифицировали белки от сердечного ядер, из них 56 (5,3%) были комментариями GO анализ, чтобы быть частью нуклеосом (одного из компонентов ядра проценты). Другое исследование, глядя на все сердца, определили 6180 белков, из которых только 11 белков (0,18%) были аннотированный быть частью нуклеосом ^21. Это еще раз свидетельствует о силе нашего протокола к meaningfuLLY обогащения ядерных белков.

5. Гель белков и ферментных белков Digest

Белки отделить от одномерного SDS-PAGE и трипсин расщепляют будет работать на масс-спектрометре.

1. Разморозить образцы на льду и определить концентрацию белка для каждого образца с помощью bicinchoninic кислоты (BCA) анализа белка.
2. Развести образцы с известной концентрацией использовании 5x буфера Laemmli, кипятить в течение 10 мин и хранят при температуре -20 ° С в течение одного-мерном SDS-PAGE. Развести образцы известной концентрации с использованием мочевины буфера для экстракции и хранят при -20 ° C в течение двух-мерных гели.
3. Выполнить геля выбора загрузки равное количество белка в каждой полосе. Белки могут быть перенесены на нитроцеллюлозные мембраны, которые будут использоваться для вестерн-блоттинга (как и управления в шаге 4,1) или полосы могут быть сокращены для масс-спектрометрического анализа, см. следующие действия.
4. Удалите гель от устройства с использованием деионизированной воды, чтобы перевести его на чистый контейнер.Крышка гель в Иволга пятно, и оберните контейнер в алюминиевую фольгу, чтобы блокировать свет. Разрешить гель для инкубации при комнатной температуре на шейкере в течение не менее 90 мин.
5. Изображение Иволга-окрашенный гель (рис. 3) с помощью УФ-света, и отметьте, где полосы будут сокращены на изображении. Режем каждой полосе приблизительно в 25 2-мм полосы для исследования измерения полного протеома.
6. Поместите гель на чистую поверхность. Используйте только материалы, которые хранились запечатанные или опрыскивают этанола для предотвращения загрязнения кератина. Вырезать из каждой группы, а затем дополнительно нарезать его на 3 равные части. Поместите все три части каждой полосы вместе в своей маркировкой 1,5 мл трубки. Гель части могут храниться при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев.
7. Подготовка геля пробки для ферментативного расщепления. Дайджест гель части, используя трипсин при 37 ° С в течение ночи. Для подробного протокола образец геля см. наши предыдущие публикации. ²² Вы можете переварить низким молекулярным весом полосы с химотрипсин вместо трипсина,для устранения обширных расщепления трипсином в гистона хвосты.

6. Масс-спектрометрия и анализ данных

Образцы разделяли на LC и проанализированы MS / MS. Спектры искали против белка, базы данных для идентификации белков.

1. Выполнить по 10 мкл каждого образца через LC / MS / MS. Мы используем нано-поток Eskigent LC с 75 мкм колонке с обращенной фазой. Используйте перспективе LC оптимизированы для целого ряда белков и пептидов. Применять линейный градиент от подвижной фазы (0,1% муравьиной кислоты, 2% ацетонитрила [ACN] в воде) для подвижной фазы B (0,1% муравьиной кислоты, 20% воды в ACN): 60 мин с 5% мобильного B фазы до 50 % B, то 15 мин от 50% В до 95% B и, наконец, 10 мин при постоянном 95% B. Используйте скорость потока 200 л / мин. Приобретать масс-спектрометрии данных в зависимости от данных режиме. Мы используем Orbitrap Thermo, что фрагменты Топ 6 самых распространенных ионов родителей.
2. Повторите работает, по крайней мере, три биологические и два технических повторов. (Recommended)
3. Используйте программное обеспечение (коммерчески доступные опции включают BioWorks и Xcalibur;! Публично доступных опций включает Prowl, X Tandem, SpectraST) для поиска спектров в базе данных Uniprot выбор с помощью алгоритма поиска (например, SEQUEST или талисман).
4. Рассмотреть вопрос об изменении параметров поиска, чтобы обеспечить carbamidomethylation цистеин и метионин окисления, два общих модификаций, созданные во время обработки образцов.
5. Рассчитать процент ложных срабатываний с использованием обратного поиска по базе данных.
6. Фильтр белка идентификации принимать только матчи порог доверия. Мы рекомендуем следующие параметры для начала: Xcorr> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (+4); deltaCN> 0,1, консенсус баллов ≥ 20, масса толерантности 2 Da для родительских ионов, массы толерантности от 0,5 Da продукта иона, по крайней мере, 2 уникальных пептидов, белков и в не более 3 пропустил раскол.

7. Этикетка без количественного

Детеrmine относительное содержание белков с использованием этикетки без количественного определения (рис. 4).

1. Количество программ являются публично или коммерчески доступных для этикетки без количественного массовой спектрометрии данных, включая переписи населения (группа проф Yates), ²³ Elucidator (Microsoft), ²⁴ сито (Thermo Scientific), ²⁵ Эшафот (Proteome Software) ^26. Эти программы направлены на коррелируют масс-спектрометрического сигнала нетронутым пептиды или число пептидных последовательностей событий с относительными величинами белка между двумя или более государствами.
2. Хотя каждая программа включает в себя аналогичный трубопровод анализ некоторых программ ограничен типа конкретного анализа, которые можно выполнять с данными. Изначально данные из различных трасс выравнивается, интенсивность сигнала нормирована и пептидных пики отобранных для анализа.
3. Два наиболее распространенных методов количественной основе спектрального учета или LC-MS площади пика. ИзобилиеКоэффициенты рассчитываются для определения изменений в пептидных обилие между различными группами.
4. Эти программы могут быть сопряжены с протеомных алгоритмы поиска (Mascot, SEQUEST, X! Tandem), коррелируют количественной информации идентификации белков.
5. Для обеспечения точности и воспроизводимости данных очень важно включать в себя как биологические (различные экспериментальные образцы) и технические (под управлением той же пробы на масс-спектрометре несколько раз) повторов массу данных спец.
6. Изменение пептида и изобилие в экспериментальных условиях можно судить по ANOVA и построены с помощью PCA (рис. 5).

Важные соображения для печати этикеток без количественного анализа. При выполнении этикетки без количественного, особое внимание должно быть уделено обеспечению последовательной подготовки образца, время переваривания и LC-MS/MS условий каждого образца должны быть обработаны и проанализированы отдельно. В отличие от встретилисьabolic подходов маркировке, этикетке сравнения в свободной эксперименты выполнены на данных из различных масс-спектрометрии работает (из-за отсутствия маркировки исключает возможность запуска их вместе), что требует высокой воспроизводимости во всех аспектах анализа образца (т.е. пробоподготовки, LC и MS шагов) и использования спектрометры с высокой точностью массы массы.

Чтобы учесть незначительные изменения в пробоподготовки и анализа известных стандартов могут быть добавлены к каждому образцу для оказания помощи в нормализации данных. Кроме того, большинство программ позволяют нормализации интенсивности сигналов (например, с учетом особенностей фонового шума или известных обильные аналита) после сбора данных для учета различий в инъекции, ионизации и фрагментации. Выравнивание алгоритмы существуют в большинстве вышеуказанном патенте программ, которые помогают в устранении различий в профилях элюции пептидов. Использование биологических и технических повторяет является по существупространственной В этом типе исследования, так как позволяет статистического анализа для подтверждения воспроизводимости и последовательность любых наблюдаемых изменений белка изобилия.

Результаты

Рисунок 4 подчеркивается полезность этой формы относительного количественного определения. Показанный на левой панели находятся отдельные пики моноизотопном пептид (обложил из разных мышей), которые были обозначены как принадлежащие к белка HMGB1 (определяется через поиск в б?...

Обсуждение

Два основных методов ядерной изоляции были рассмотрены ранее: ²⁷ одно Беренс техники гомогенизации лиофилизированных тканей в неводных растворителей и второй, модификация, которую мы используем здесь, гомогенизации ткани в водный сахароза / солевой раствор следует дифференциал?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Dulbeco изменения Eagle Средний	Invitrogen	11965
Протеаза гранул	Roche	04 693 159 001
100 мкм фильтр	BD Falcon	352360
Ultracut ультрамикротомом	Reichert
100CX просвечивающей электронной Микроскоп	JEOL USA, Inc
Иволга	BioRad	161-0496
Гистон антител H2A	Санта-Крус	SC-8648
Nucleoporin p62 антитела	BD Biosciences	610498
Аденин нуклеоантитела прилива транспортер	Санта-Крус	SC-9299
BiP антител	Санта-Крус	SC-1050
Тубулина антителами	Сигма	T1568
Гистона H3 антитела	Abcam	ab1791
Фибрилларин антител	Cell Signaling	C12C3
SNRP70 антител	Abcam	ab51266
E2F-1 антителами	Thermo Fisher	MS-879
Ретинобластома антител	BD Biosciences	554136
Гипоксия фактор-1 антитела индуцибельной	Novus биологические препараты	NB100-469
BCA анализа белка	Thermo Scientific	23227
Обратный фазы колонки	Новый Objэффективная	PFC7515-B14-10
BioWorks Browser	Thermo Scientific