Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter

Резюме

Опишем аналитический метод оценки срока службы глутамата астроцитов в мембранах из электрофизиологических записей глутамата токи транспортера в астроциты.

Аннотация

Высокая плотность транспортеры глутамата в мозге находится в астроциты. Глутамат пару транспортеры движение глутамата через мембрану при содействии транспортировки 3 Na ⁺ и 1 H ⁺ и противоположно направленного транспорта 1 К ^+. Стехиометрического ток, генерируемый транспортного процесса можно контролировать с цельноклеточная патч-зажим записи из астроцитов. Временной ход записан текущий формируется временной ход глутамата профиль концентрации в котором астроциты подвергаются, кинетика глутамата транспортеры, и пассивный электротоническим свойства астроцитов мембран. Здесь мы описываем экспериментальных и аналитических методов, которые могут быть использованы для записи глутамата токи транспортера в астроцитах и ​​изолировать временной ход глутамата зазор от всех других факторов, которые определяют форму волны тока астроцитов транспортер. Методы, описанные здесь, могут быть использованы для оценки времени жизни оF-вспышкой и Uncaged синаптически выпустили глутамата на мембранах астроцитов в любом регионе центральной нервной системы во время здоровья и болезни.

Введение

Астроциты являются одним из наиболее распространенных типов клеток в мозге со звездообразной морфологии и мелкие выступы мембраны, которая распространяется на всю нейропилей и достичь ^1,2 соседних синаптических контактов. Клеточной мембраны астроцитов 'плотно заполнена молекулы глутамата Перевозчик ^3. В физиологических условиях глутамата транспортеры быстро связывать глутамат на внеклеточный стороне мембраны и передавать ее в цитоплазме клетки. Поступая таким образом, транспортеры поддерживать низкие базальные концентрации глутамата во внеклеточном пространстве ^4. Глутамат транспортеры в хорошую астроцитов процессов, прилегающих к возбуждающих синапсов идеально расположены для связывания глутамата выделяется при синаптических событий, как это диффундирует из синаптической щели. Поступая таким образом, транспортеры глутамата также ограничить побочные к пери-и экстра-синаптических регионах и на соседние синапсы, уменьшая пространственное распространение возбуждающего сигналасек в мозге ^5-7.

Глутамат транспорт электрогенных процесс стехиометрически сочетании с движением 3 Na ⁺ и 1 H ⁺ вдоль их электрохимического градиента и противоположно направленного транспорта 1 К ^{+ 8.} Глутамат транспорта связан с (но не стехиометрическом соединены с) анионные проводимости проницаемой для SCN ^- (тиоцианатом)> NO ₃ ^- (нитрат) ≈ ClO ₄ ^- (перхлораты)> I ^-> Br ^-> Cl ^-> F ^-, а не СН ₃ SO ₃ ^- (метансульфоната) и C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- (глюконат) ^9-11. Оба токов (стехиометрические и нестехиометрическое) могут быть записаны путем получения цельноклеточная патч-зажим записи из астроцитов, визуально, выявленных в рамках Dodt освещения или инфракрасных дифференциального интерференционного контраста (IR-DIC) в acutэлектронной срезах мозга ^12. Стехиометрического составляющей тока, связанных с глутаматом транспорт через мембрану может быть выделен с помощью CH ₃ SO ₃ ^- или С ₆ Н ₁₁ О ₇ ^- на основе внутриклеточных растворов и может быть вызвано с помощью флэш-uncaging глутамата на астроциты ^13,14, или путем активации высвобождение глутамата из соседних синапсов, либо электрическим, ¹² или с целевой контроль optogenetic.

Временной ход стехиометрического компонент транспортер ток имеет форму временем жизни глутамата профиль концентрации при астроцитов мембраны (например, глутамат зазор), кинетика глутамата транспортеры, пассивный свойства мембраны астроцитов, а в синаптической стимуляции, к синхронность высвобождение глутамата через активированный синапсы ^13. Здесь мы опишем во всех деталях: (1) экспериментальная провертренере, чтобы изолировать стехиометрического компонентом глутамат токов транспортер с цельноклеточной патч-зажим записи из астроцитов использованием острого мышь срезах гиппокампа в качестве примера экспериментального препарата, (2) аналитический метод для получения временной ход глутамата очистка от этих записей ^{13, 14.} Эти методы могут быть использованы для записи и анализа глутамата токов транспортер из астроцитов в любой области центральной нервной системы.

протокол

1. Подготовка Slice

1. Подготовьте 500 мл нарезки / хранения раствора, содержащего (в мм): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl _2, 1,3 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 4 MgCl _2, 26,2 NaHCO _3, 1 NaH ₂ PO _4, 22 и глюкозы, 320 мОсм, рН 7,4
2. Используйте 250 мл стакан подготовить камеру для погружения ломтиками, залейте его 200 мл нарезки / решение для хранения данных, согрейте его в водяной бане при 34 ° С и пузырь его с 95% O _2, 5% СО _2.
3. Держите оставшуюся нарезки / решение для хранения данных в стеклянной бутылке при 4 ° C.
4. Используйте цианакрилатный клей для прикрепления небольшой блок агара (6%, подготовленный в ACSF) на Vibratome держатель образца и хранить его при температуре 4 ° C.
5. 30 мин до начала нарезки, поместите стеклянную бутылку, содержащую нарезки / решение для хранения данных в ведро со льдом и пузырь его с 95% O _2, 5% СО _2.

Примечание: скорость и точность имеют первостепенное значение для вскрытия действия, описанные ниже.

6. Обезболить мышь (P14-21, C57BL / 6) галотаном / ИФ (ИФ, как сообщается, повышения астроцитов поглощение глутамата ^15), обезглавить его, и опустите голову в 50 мл стакан, содержащий кислородом, холодные нарезки / решение для хранения данных.
7. Выполните рассечения мозга на лед завернутый с бумажными полотенцами и хранили при -20 ° С.
8. Используйте скальпель, чтобы сделать середине сагиттальной разрез кожи на спинной стороне головы, от фронтальной до хвостового конца, и подвергать черепа.
9. Поместите нижнюю сдвига лезвия небольшого пара хирургических ножниц в затылочной отверстие и сделать два разреза в направлении слева и справа (угол 45 °).
10. Разрежьте черепа по средней сагиттальной линии от хвостового к передним концом.
11. Снимите мозга с помощью шпателя и опустите ее в кислороде, холодные нарезки / хранение решенидалее.
12. С помощью скальпеля, сделать пять сокращений: (1) Снимите обонятельных луковиц и лобной коре, (2) удалить мозжечка; (3) снимите левый и (4) правой височной доли, (5) разделения двух полушарий мозга с середины сагиттального разреза.
13. Приложите две части головного мозга с бумажными полотенцами, чтобы удалить излишки раствора.
14. Клей боковой поверхности каждой секции мозга к холодной плите Vibratome: спинной стороне головного мозга должна быть обращена Vibratome лезвия; вентральной стороне мозга должны быть в контакте с агар блока, вдали от Vibratome лезвия.
    Примечание: для получения высококачественных ломтиками, важно, чтобы эти две части головного мозга прочно приклеен к Vibratome основанием. Чтобы сделать это, используйте цианакрилатный клей, который не слишком жидким, и что не высыхает слишком быстро.
15. Закрепите Vibratome плите в анатомическом театре камеры, установить срез йickness до 250 мкм и регулировки ширины лопасти перспективе. Продолжайте нарезки.
    Примечание: если все ориентировано правильно, Vibratome следует резки ломтиками парасагиттальной из спинной к вентральной и с медиальной стороны боковой поверхности мозга.
16. Когда лезвие прошел через кору и гиппокамп, использовать скальпель, чтобы вырезать кора / гиппокампа из мозга и поместить каждую часть в погружении камере при 34 ° С.
17. Откажитесь от первой пары ломтиков. Как правило, 12 ломтиков (250 мкм), могут быть получены из P14-21 мозга мыши.
18. Держите ломтиками при 34 ° С в течение 30 мин и дайте им остыть до комнатной температуры в течение 30 минут, прежде чем использовать их для записи электрофизиологии.

2. Astrocyte идентификации и записи

1. Подготовят внутренний раствор, содержащий (в мм): 120 KCH ₃ SO _3, 10 ЭГТА, 20 HEPES, 2 MgATP, 0,2 NaGTP,5 QX-314Br и 5 NaCl, 290 мОсм, рН 7,2.
2. Подготовка внеклеточной решение для записи, содержащему (в мМ): 119 NaCl, 2,5 KCl, CaCl _2, 2,5, 1,3 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 _MgCl2, 26,2 NaHCO _3, 1 NaHPO ₄ и 22 глюкозу, 300 мОсм, рН 7,4 , насыщенный 95% O _2, 5% СО _2.
3. Добавить следующие препараты с внеклеточной решение для записи, чтобы блокировать активацию GluA, Glun, mGluRII, mGluRIII, ГАМК, GABA _B, и A1 аденозиновых рецепторов (в мкМ): 10 2,3-диоксо-6-нитро-1 2,3,4-тетрагидро-бензо [ƒ] хиноксалин-7-сульфонамида динатриевой соли (NBQX), 10 (RS) -3 - (2-carboxypiperazin-4-ил) пропил-1-фосфоновой кислоты (CPP), (2S )-2-амино-2-[(1S, 2S)-2-carboxycycloprop-1-ил] -3 - (Ксанте-9-ил) пропановой кислоты динатриевой соли (LY341495), 100 (R, S)-α- methylserine-O-фосфат (MSOP), 100 пикротоксином, 5 3 - [[(3,4-дихлорфенил) метил] амино] пропил] диэтоксиметил) фосфиновой кислоты (CGP52432), 18-циклопентил-1 ,3-dipropylxanthine (DPCPX).
4. Установка температуры внеклеточного раствора в записи камеры; типичных температурах между 34 - 36 ° С.
5. Подготовьте патч-зажим электродов из боросиликатного стекла капилляров (R ≈ 2,5 МОм), используя двухступенчатый, стекло микропипетки съемник.
6. Возьмите одну из ломтиками и поместить его в записи камеры. Удерживайте ее с металлической арфы сделаны с платиновой проволокой и нейлоновыми струнами.
7. Осмотрите ломтиками под Dodt освещения или ИК-DIC. Астроциты могут быть идентифицированы по их маленького тела клетки (Ø = 10 мкм) и видный ядра (рис. 1).
8. Для синаптической стимуляции, поместите сталь нержавеющая биполярного электрода, ~ 100 мкм от астроцитов, которые вы планируете, чтобы исправить.
9. Патч астроцитов и перерыв в цельноклеточная конфигурации, применяя очень нежное всасывание.
   Примечание: астроциты как правило, имеют низкий входной Resistancе (~ 10 МОм), гиперполяризованного мембранного потенциала покоя (~ -90 мВ), и никакой стрельбы активности. Астроциты хранятся на его мембранный потенциал покоя в течение экспериментов в фиксации потенциала режиме (т.е. ток удержания должен показывать 0 Па). Перед каждым стимуляции, 10 мс гиперполяризующих напряжение шаг (-3 мВ) используется для контроля серии и входное сопротивление астроцитов.
10. Отменить записи если ряд изменений сопротивления> 20% или если мембранный потенциал астроцитов деполяризуется. Мембранный потенциал астроцитов могут быть непосредственно измерены путем перехода от напряжения зажим для текущего зажим режиме. Кроме того, в то время как в фиксации потенциала режиме мембранный потенциал можно контролировать путем считывания значения потенциала удерживания, что приводит к 0 Па удерживающего тока.
11. Если синаптической стимуляции используются, альтернативные одиночные и парные стимулы (например, 100 мс друг от друга), каждые 10 - 20 сек.
12. Для УФ-фотолиза ЭксперимEnts, подключите uncaging лампы Хе эпифлуоресцентной порт микроскопа и добавить в клетке соединения с внеклеточной решение. Transporter токи амплитудой ~ 100 ра может быть получена, когда флэш-uncaging 100 мкМ MNI-L-глутамата в целом поле зрения (Ø = 662,5 мкм при использовании объектив 40Х ^14). Альтернативные стимуляции светом пути открыты и заблокированы, каждые 10 - 20 сек.
13. Вызывают глутамата и переходных токов записи транспортера в контрольных условиях и в присутствии суб-насыщающей концентрации широкого спектра действия глутамата транспортер антагонист D, L-трео-β-Benzyloxyaspartic кислоты (TBOA; 10 мкМ), чтобы уменьшить амплитуду тока транспортер по крайней мере, 30% от его контрольной величины (см. разделы 4, 5), или в присутствии высокой концентрации TBOA (50 - 100 мкМ), чтобы блокировать транспортер токов полностью изолировать и устойчивого К ^+-тока (см. раздел 3) .

3. Pharmacгические Выделение Устойчивый К ⁺ тока

1. Запись астроцитов токов в контрольных условиях и в присутствии высокой, насыщающей концентрацией TBOA (50 - 100 мкМ).
2. Средний по крайней мере 20 разверток в TBOA (50 - 100 мкМ).
3. Fit усредненный следы, полученные в 3.2 с функцией:
   
   Примечание: TBOA регистра компонент (то есть тот, который записан в присутствии TBOA (50 - 100 мкМ)) представляет собой устойчивый К ^+-ток. Его время, конечно аппроксимируется моно-экспоненциальной функции описанных выше.
4. Повторите этот нужным различных астроцитов и получают среднее значение _ростом Τ (т.е. среднее время нарастания устойчивого К ^+-тока (см. раздел 5)).

4. Яsolation облегченного Часть синаптически-активированный Токи Transporter (fSTCs)

1. Средний по крайней мере 20 разверток получены с парными стимуляции, в контрольных условиях и в TBOA (10 мкМ) (левый рисунок 2а).
2. Средний одинаковое число итераций, полученные с одного стимуляции, в контрольных условиях и в TBOA (10 мкм) (рис. 2, в центре).
3. Сравнение амплитуды среднего тока ответ на -3 шаговое напряжение мВ в четырех усредненных следы (контроль одного импульса, контроль парные импульсы, TBOA одного импульса, TBOA парных импульсов).
4. Если амплитуда текущий ответ одинаково во всех четырех графиков, перейдите к шагу 4.7.
5. Если амплитуда средний ток ответ отличается в любом из четырех следов убедитесь, что все отдельные следы были соответствующими должны быть включены в среднем.
6. Если амплитуда среднего тока отличается в любом из четырех следов, но всеиндивидуальных следов подходящие для включения в среднем проверить, что в каждой трассы размер FSTC масштабируется линейно с размером текущий ответ на этапе испытательного напряжения. Если это так, то масштабировать все следы по отношению друг к другу так, что ток в ответ на этапе испытательного напряжения равны по амплитуде.
   Примечание: В записи условий, описанных здесь (т.е. внутриклеточные CH ₃ SO ₃ ^- или C ₆ H ₁₁ O ₇ ^-), синаптической стимуляции возбуждающих аксоны генерировать астроцитов токов с сложной формы, состоящий из быстрого роста переходных внутрь стехиометрического тока и медленного -рост, устойчивый внутренний K ^{+-отражающие} текущие K ⁺ переуравновешивания во внеклеточном пространстве после распространения потенциала действия вдоль соседних аксонов. Очень важно, чтобы удалить этот устойчивый K ^+-ток, как и любой остаточный ток приведет кпереоценить глутамата жизни.
7. Вычтите среднем следа, полученные с одного раздражения от среднего следа получены с парными стимуляции (справа рис. 2а). На этом этапе можно изолирующий стехиометрического и устойчивого К ^+-ток, вызванный второго стимула.
8. Сдвиг среднего следа, полученных с одного стимуляции промежутком времени, который соответствует между импульсом интервал, используемый для доставки парных импульсов (например, 100 мс) (рис. 2б).
9. Вычесть со сдвигом во времени среднее ответом, полученным с одним стимуляции от среднего ответ на второй стимул, полученный в 4,7 (рис. 2в). Этот шаг изолирует способствовало части транспортера текущего вызванные второй стимул (FSTC).
10. В большинстве случаев на предыдущем шаге удаляется полностью устойчивым К ^+-ток. Если это так, то выделение FSTC завершена, и вы можете процедурред с деконволюции анализа и получения временной ход глутамата зазор из астроцитов. В некоторых случаях, однако, небольшие устойчивого К ^+-ток все еще ​​присутствует (фиг. 2d) и дальнейший анализ не требуется (см. раздел 5).
    Примечание помнить, что анализ, описанный в 4.7-4.10 должны быть выполнены в среднем следов, полученных в контрольных условиях и в TBOA (10 мкМ).

5. Вычитание остаточной zdustained K ^+-ток от fSTCs

1. Измерение амплитуды устойчивого К ^+-ток оставшихся после выполнения анализа, описанного в разделе 4.
2. Масштабирование амплитуды моно-экспоненциальной функции описаны в 3,3 к амплитуде остаточного устойчивого К ^+-ток, измеренный в 5,1 (рис. 2d левой и средней). Для этого в уравнении 3.3, установите срок равна амплитуда устойчивого К ⁺ тока мнеasured в 5,1 и срок _ростом Τ равна среднему значению Τ _рост оценивается в 3,4.
3. Вычтите полученное моно-экспоненциальной функции от FSTC и устойчивые K ^+-ток, полученный в 4.10 (рис. 2d справа). Этот шаг завершает изоляцию FSTC.

6. Выделение флэш-активированной Токи Transporter (FTCs)

1. Средний по крайней мере 20 разверток, полученных с оптического пути открыты, в контрольных условиях и в TBOA (10 мкМ).
2. Средний одинаковое число итераций, полученных с оптического пути закрыты, в контрольных условиях и в TBOA (10 мкМ).
3. Сравнение амплитуды тока ответ на -3 шаговое напряжение мВ в четырех усредненных следы (контроль одного импульса, контроль парные импульсы, TBOA одного импульса, TBOA парных импульсов).
4. Если амплитуда текущий ответ одинаково во всех четырех графиков, перейдите к шагу 6.7.
5. Если амплитуда средний ток ответ отличается в любом из четырех следов убедитесь, что все отдельные следы были соответствующими должны быть включены в среднем.
6. Если амплитуда среднего тока отличается в любом из четырех следов, но все отдельные следы являются подходящими для включения в среднем проверить, что в каждой трассы с пути света открыть размера FTC масштабируется линейно с размером текущий ответ на шаг испытательного напряжения. Если это так, то масштабировать все следы по отношению друг к другу так, что ток в ответ на этапе испытательного напряжения равны по амплитуде.
   Примечание: в записи условий, описанных здесь (т.е. внутриклеточные CH ₃ SO ₃ ^- или C ₆ H ₁₁ O ₇ ^-), флэш-раздражители генерировать токи астроцитов, состоящие только из быстрого роста переходных стехиометрического входящего тока.
7. Вычтите среднем след получены со светом погладитьч заблокирован от среднего следов, полученных с оптического пути открыты. Этот шаг позволяет удалить артефакт стимула и выделение FTCs.
   Примечание: анализ, описанный в 6,7 должны быть выполнены в среднем следов, полученных в контрольных условиях и в TBOA (10 мкМ).

7. Деконволюция анализа

1. Установите Transporter ток (FSTC или FTC), записанные в контрольных условиях (рис. 3, слева) и в TBOA (10 мкм) (правый рисунок 3а) и выделяли, как описано в разделах 4 - 6, с мульти-экспоненциальной функции:
   
2. Создать функцию мгновенного роста, распадающаяся моно-экспоненциально в соответствии с функцией:
   
   икоторая лучше всего описывает распадающейся фазе Transporter текущего записан в TBOA (10 мкм) (рис. 3б).
   Примечание: функция, описанная в 7.2 (т.е. H (т)) представляет собой время, конечно глутамата зазор из астроцитов в присутствии TBOA (10 мкМ).
3. Деконволюции моно-экспоненциальная функция, полученная в 7,2 (рис. 3б и 3в середине) из фита транспортера текущего записан в TBOA (10 мкм), полученный в 7,1 (рис. 3, справа, С слева).
   Примечание: деконволюцией это математическая операция, включены во многие программное обеспечение для анализа пакетов, таких как (например, Matlab, Python). В IgorPro, программный код, который мы обычно используем для выполнения этого вида анализа, деконволюции операция может быть эффективно вычислено, как описано ниже, с использованием быстрого дискретного преобразования Фурье. Во-первых, с помощью операции БПФ для вычисления диscrete быстрого преобразования Фурье с моно-экспоненциальной функции, полученные в 7.2 и в приступе Transporter текущего записан в TBOA полученные в 7.1. Затем с помощью операции IFFT для вычисления обратного быстрого дискретного преобразования Фурье отношение двух функций FFT. В результате функции I (т) может быть описан следующим образом:
   
   Стадии, описанной в 7,3 позволяет выводе фильтр транспортера тока в TBOA (10 мкМ) (рис. 3c справа). Фильтр представляет искажающих факторов, которые превращают жизнь глутамата на мембранах астроцитов в текущем Transporter изолированы в разделах 4 - 6 (т.е. FSTC или FTC).
4. Деконволюции фильтра (рис. 3в право, Фигурное 3D середине) из фита транспортера тока в контрольных условиях (рис. 3, слева, рис 3d слева).
   Примечание: Этот шаг позволяет выводе временной ход оформления глутамата из астроцитов в контрольных условиях (рис. 3 справа). Предположения, лежащие в основе этого деконволюцией шагом является то, что временной профиль фильтра остается неизменной в контрольных условиях и в TBOA (10 мкм).
5. Для получения количественной оценки общего хода времени глутамата оформление, расчет центра тяжести (Ф) колебательного сигнала, полученного на стадии 7.4. Это делается путем расчета Ф как:
   
   где G (T) сигнала, полученного на стадии 7.1. В уравнении описано выше, термин т соответствует времени, в течение которого окно интеграл вычисляется.
   Обратите внимание: когда этот метод был впервые создан,Ф рассчитывали с течением времени окна, которые остались неограниченной ^13. Этот подход может быть использован при условии, интеграция окна устанавливается быть шире, чем продолжительность глутамата оформления и распады оформление сигнала полностью возвращалась к базовому уровню. Если это не так, однако, этот метод оценки Ф встречает некоторые ограничения. Например, если зазор сигнала не затухает точно возвращалась к базовому уровню, то ф возрастает с увеличением ширины интеграции окна. Во избежание потенциального источника погрешности для оценки Ф, мы теперь вычислить ее в течение временного окна соответствует 10% от пикового транспортера тока до и после ее начала ^14. Последний подход улучшает последовательность, с которой Ф измеряют на клетки. Это очень удобно, особенно при анализе малых эффектов фармакологических методов лечения от времени ход оформления.

Результаты

Успех аналитический подход, описанный здесь критически зависит от получения высококачественных электрофизиологических записей транспортера токи из астроцитов в любой области центральной нервной системы. При острых срезов гиппокампа мыши, астроциты могут быть легко идентифицирова?...

Обсуждение

Здесь мы опишем экспериментальный подход, чтобы получить электрофизиологических записей из астроцитов, аналитический протокол для изоляции глутамата токи транспортера в астроцитах и ​​математические методы для получения временной ход глутамата зазор от астроцитов токов транспор?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 disodium salt	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX disodium salt	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-glutamate	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Optional
Matrix electrodes	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller	Narishige	PC-10
Loctite 404 instant adhesive	Ted Pella	46551
Xe lamp	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics