JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Аннотация

Адаптивного иммунитета регулируется динамического взаимодействия между Т-клетками и антиген-представляющих клеток ("БТР") называют «иммунологических синапсов». В этих интимных межклеточных интерфейсов дискретные суб-кластеры сотовой МНС / Ag-TCR, F-актина, адгезия и сигнальные молекулы образуют и быстро переделывать. Такая динамика, как считается, критические детерминанты как эффективность и качество иммунных ответов, которые развиваются, и поэтому защитных против патологического иммунитета. Современное понимание иммунологических синапсов с физиологической БТР ограничивается неадекватности получаемой разрешением изображения. Хотя искусственные модели подложки (например, плоские липидных бислоев) предлагают превосходное разрешение и чрезвычайно ценный инструмент, они по своей природе не физиологическая, а упрощенное. Сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки превратились в важную периферических тканей (или стромальных) отсеке "полу-профессииаль БТР. Эти бронетранспортеры (которые выражают большую часть молекулярных машин профессионального БТР) имеют уникальную особенность формирования практически плоскую поверхность клеток и легко transfectable (например, с флуоресцентным белком журналистами). В этом основной подход к осуществлению эндотелиальные клетки в качестве нового и физиологический "плоской модели сотовых APC 'для улучшения изображений и опроса основных антигенных обрабатывает сигнализацию будут описаны.

Введение

Т-лимфоциты являются филиал адаптивной иммунной системы характеризуется способностью эффективно распознавать пептид антигена (АГ), связанного с главным комплексом гистосовместимости (МНС) молекул через их Т-клеточных рецепторов (TCR) 1. Наивные лимфоциты мигрируют конструктивно и сканирования »профессиональные Ag представляющих клеток (АПК»; например, дендритные клетки) в лимфатических узлах, в то время как память / эффекторные Т-клетки должны эффективно обследовать чрезвычайно широкий спектр БТР и потенциальных целевых клеток в периферических тканях.

В следующем мин первоначального признания родственных Ag на БТР, лимфоциты арестовать их миграции и начинают формировать специализированные интимную интерфейс клетка-клетка называется "иммунологическое синапсов» (IS). Устойчивый (т.е. 30-60 мин) контакты должны усиливать и поддерживать сигнализации 2-7. Новые исследования определить, что в есть, это непрерывное образование и быстрое гemodeling дискретных субклеточном сигнализации микро-кластеров (т.е., содержащих МНС / Ag-TCR, F-актин, адгезию и сигнальные молекулы), которые определяют силу и качество в результате иммунных ответов 2-7. Тем не менее, динамические данные и механизм регулирования этого процесса полностью понял 8,9. Это связано в основном с техническими проблемами, связанными с неправильной топологии поверхностей APC и плохо контролируемой ориентации плоскостей взаимодействия клетка-клетка, вопросов, которые глубоко ограничивают необходимую пространственно-временной обработки изображений подходов 8-10 (Figure1A).

figure-introduction-1764

Рисунок 1. Физиологическая Planar сотовый APC Модель изображений иммунологии Synapse Dynamics. Схема иллюстрирует традиционный изображений иммунологической синапса между Т-клетки и профес NAL APC (А) и Т-клеток и традиционный плоский липидов модель бислой APC (В) по сравнению с этой новой модели эндотелиальной плоской APC (C). Профессиональные БТР обеспечить физиологические иммунологические синапсы, но предлагают мало ориентированный интерфейс клетка-клетка (т.е., по отношению к оптимальной плоскости изображения ху, разрешение ~ 0,2 мкм), что резко компрометирует пространственное (г визуализации самолет разрешения ~ 1 мкм) и временная (т.е. в связи с необходимостью многократно сканировать всех плоскостях изображений г) разрешение изображения. Двухслойные модели имеют плоскую топологию, что обеспечивает оптимальную пространственно-временной изображения разрешением, но также сильно упрощенной, не физиологические и жесткой. Это эндотелия модель сотового сочетает в себе плоскую топологию липидного бислоя с физиологической подложки классического APC, чтобы доставить оптимального пространственное и временное разрешение изображений в физиологическом обстановке.м / файлы / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Предыдущие исследования частично обойдена эти препятствия путем разработки моделей плоскую подложку (т.е. липидных бислоев и поверхностей покрытых антителами), которые обеспечивают оптимальную пространственно-временной разрешение (т.е. с помощью фиксации поверхность активации Т-клеток в единый план, параллельной оптимальной визуализации ху Плоскость) 11-15 (Фигура 1В). Эти модели способствовали важные идеи в субклеточных / молекулярной динамики, которые контролируют антигенный сигнализации в Т-клетках, в том числе открытие динамического актина / TCR сигнализации микро-кластеров 7,11-14. Тем не менее, такие модели изначально упрощать, а также жесткой (исключающее развитие / изучение 3-мерных топологических особенностей) (рис 1B). Таким образом, остается неясным, как связать такие выводы PHYsiologic клетка-клетка иммунный надзор.

Хотя до сих пор изучено недостаточно, сосудистой и лимфатические эндотелиальные клетки возникают, как большой (т.е. больше, чем в цифрах всех профессиональных БТР, на ~ 1000 раз) периферической отсеке "полу-профессиональной" БТР 16-18. Эти клетки экспрессируют MHC-I-, MHC-II- и множество молекул со-стимуляторов (например, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1ВВ, OX40L, TL1A, PD-L1, но не CD80 и CD86) и стратегически расположенный на границе кровь-ткань, где они служат специализированные функции дозорных 16-18. Предыдущие исследования показали, что эндотелиальные клетки могут эффективно повторно стимулировать эффекторной / память, но не наивным, Т-клетки 19-25. Таким образом, эндотелиальные клетки, вероятно, играют уникальную роль в эффекторной APC фазе адаптивных иммунных реакций в пределах периферических тканях, таких как локального воздействия на активацию Т-клеток, дифференцировки, памяти и толерантности 16,17,26. Крически, при выращивании в пробирке, эндотелиальные клетки образуют практически плоские поверхности клеток и легко transfectable (например, с флуоресцентным белком журналистами). Эти особенности идеально подходят для высокой пространственно-временной разрешающей способностью топологических динамики при межклеточных взаимодействий 19,27. Таким образом, эндотелиальные клетки может служить физиологический "плоской сотовой APC» модели отчетливо подходит для изучения субклеточных / молекулярные механизмы ремоделирования, которые управляют распознавания антигенов и регулируют ответов (рис 1в) 19,20.

Ранее установлено, комплементарные методы визуализации (в том числе трансфекции эндотелии клеток с флуоресцентными производителей белка мембраны плазмы и цитозоле) для изучения деталей лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия при адгезии и трансэндотелиальной миграции 27, показали, что лейкоциты активно зондировать поверхность эндотелии динамического вставкад втягивание субмикронных масштабах, актин-богатых цилиндрические выступы (~ 200-1000 нм в диаметре и глубиной) называется invadosome, как выступы (то есть, "ILPs ') 27,28. Эти подходы изображений были расширены наряду с созданием протоколов, чтобы воспользоваться функцией эндотелия APC развивать первые методы пространственно-временной высокой разрешающей способностью в Т-клеток-эндотелиальной иммунологической синапса Как сообщалось 19,20 и далее описанных здесь. Центральный вывод, производный от этого романа плоской модели APC сотовой том, что Т-клеточные ILPs функционировать как в поощрении начального обнаружения Ag и в поддержании последующее сигнализации. В самом деле, массивы нескольких ILPs (которые были стабилизированы и начисленных в ответ на начальный поток кальция) Показать обогащение TCR и молекул наводящий активного сигнального такой ПКС-Q, ZAP-70, фосфотирозина и HS1. Таким образом, ILPs-видимому, представляют собой трехмерную физиологическую эквивалентную ТКР сигнализации микрокластеры видели в плоских моделей двухслойных. Этот подход, таким образом, чутко показывает / отчеты молекулярные и архитектурные (и подразумеваемые биомеханические) динамика не иначе обнаруживается.

Метод, описанный в данном документе должны быть полезными для преодоления разрыва между профессиональной APC и искусственных моделей APC субстрата для того, чтобы укрепить нашу способность допросить основные механизмы адаптивного иммунного ответа. В то время как здесь акцент делается на активацию CD4 + Th1-типа эффектора / ячейки памяти, это основной подход можно легко модифицировать для изучения широкий спектр типов Т-клеток и AGS, как описано ниже.

протокол

Все эксперименты, описанные в этом протоколе проводятся с первичных человеческих Т-клеток и коммерчески доступных первичных человеческих эндотелиальных клеток (кожная или легких микрососудистой ECS) Любой протокол исследования с участием человека должны быть одобрена этическим комитетом и письменное информированное согласие должно быть дано от каждый донор крови. Эксперименты, проведенные с помощью этого протокола были утверждены IRB из медицинского центра Beth Israel дьяконица.

1. Подготовка человека CD4 + Th1 Эффектор / Т-клетки памяти

  1. Применить жгут на руку донора, протрите вену с алкоголем, и вставьте иглу. Медленно привлечь 15 мл крови в вакуумные с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. Когда кровь была составлена, развязать жгут перед удалением иглы. Сразу оказать давление на раны стерильной марлей, когда игла удаляется.
  2. Передача кровь на 50 мл пробирку. Добавить RPMI-1640 при комнатной температуре в 1: 1 разбавления (конечный объем 30 мл). Тщательно наложить разбавленнойд крови на двух 50 мл пробирок, содержащих 15 мл предварительно отфильтрованного лимфоцитов изоляции средой, такой как Ficoll-Пак при комнатной температуре.
  3. Центрифуга градиент при КТ в течение 30 мин при 1200 х г в роторе Бакет. В то время как центрифугирование подготовки Т-клеток среду (500 мл RPMI-1640, 50 мл FCS, 5 мл пенициллина / стрептомицина).
  4. При удалении 50 мл пробирку из центрифуги, наблюдать четыре слоя: гранулы эритроцитов в нижней части, в Пак, слой клеток, который содержит лейкоциты (в том числе лимфоцитов) и плазму. Осторожно удалите белый слой клеток крови с пипетки Пастера и передачи в 50 мл Сокол трубки.
  5. Промыть белый слой клеток крови путем добавления RT RPMI-1460 (до 20 мл) и центрифугировали при комнатной температуре в течение 5 мин при 1200 х г в. Ресуспендируют белых кровяных клеток в 1 мл среды Т-клеток. Добавьте 5 мкл 1 мл клеточной суспензии в 250 мкл среды Т-клеток в 1,5 мл центрифужную пробирку и осторожно перемешать вверх и вниз с помощью пипетки.
  6. Добавить 25 мкл разбавленныхд клеточной суспензии до 25 мкл 0,4% трипанового синего. Добавить 10 мкл смеси в каждую сторону от стандартного гемоцитометра.
  7. Поместите гемоцитометр на малой мощности светового микроскопа. Использование цели 10X подсчитать количество живых клеток, которые исключены синий краситель трипанового и присутствуют в средней площади с обеих сторон гемоцитометре.
  8. Для расчета концентрации клеток, умножьте среднем 2 квадратов по 100 (коэффициент разбавления), а затем умножить на 10, чтобы дать 4 число клеток / мл.
  9. Регулировка конечной концентрации 0,5 × 10 6 клеток / мл в Т-клеточной среде. Добавить конечной концентрации 1 мкг / мл каждого из бактериальных суперантигенам стафилококковый энтеротоксин В (SEB) и токсин синдрома токсического шока 1 (TSST) к клеткам. Культура в течение 72 ч (37 ° С и 5% CO 2), чтобы расширить популяцию клеток CD4 + Т.
  10. Пелле Т-клетки (1200 XG, 5 мин) и ресуспендируют в 0,5 х 10 6 клеток / мл в Т-клеточной среде сДобавление человеческого IL-15 (20 нг / мл). Передача лимфоцитов к T150 колбу. Продолжать расширять / разбить ячейки в полном среднесрочной IL-15 каждый час 24-48 при необходимости (на основе цвета СМИ, то есть, всякий раз, когда средства массовой информации оказывается от розового до светло-желтого) после этого. Поддерживать результате популяции лимфоцитов на срок до 15 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По дизайну, этот протокол будет активировать и расширить специально подмножество CD4 + Т-клеток, которые реагируют на SEB и TSST, а затем вести их в сторону Th1-подобный фенотип эффектор / память. Другие лейкоциты не выживают и растут в этих условиях, например, что за шагом 1,10 клетки будет по меньшей мере 95% CD4 +, CD45RO + Т-клеток 19, как легко оценена с помощью проточной цитометрии. При желании, дальнейшей очистки может быть легко достигнуто путем коммерчески доступного антитела / магнитного бисера, основанных положительных или отрицательных комплектов отбора.

2. Начиная первичных человеческих эндотелиальных клеток культуры

<ол>
  • Шерсть Т25 колбы с фибронектином (FN) 20 мкг / мл в PBS в стерильных условиях. Оставить при комнатной температуре в течение 30-60 мин. Удалить FN и добавить 5 мл полной среды (эндотелия базальной среде (ДМ-2), дополненной роста эндотелия среды (ВОСА-2) singlequots). Предварительно инкубат в 37   ° С клеточной культуры инкубатор, по крайней мере 30 мин.
  • Оттепель флакон замороженных человека легких или кожная микрососудистых эндотелиальных клеток (HLMVECs или HDMVECs) в водяной бане при 37 ° с редкими осторожном перемешивании для ~ 2-3 мин. Сразу передачи клетки T25 колбу, содержащую подогретого СМИ. Аккуратно водоворот и место в инкубаторе при 37 ° С.
  • Изменение СМИ после ~ 4-6 ч. Продолжить, чтобы изменить средств массовой информации примерно каждый 48 ч (или при массовой информации становится слегка желтого) до пластины не достигает ~ 90-95% слияния.

    • 3. Генеральный дробление и расширение эндотелиальных клеток

    1. Рост клеток до ~ 90-95 конфлюентности. Это может занять 2-5 дней. Для расщепления,удалить средства массовой информации и промыть PBS. Удалить PBS и заменить с минимальным объемом свежего 1x трипсина (0,5 мл для T25 или 1,5 мл для T75). Аккуратно водоворот, чтобы покрыть всю поверхность с трипсином. Выдержите в 37 ° C в течение ~ 5 мин. Монитор отряд клеток из пластины с использованием малой мощности светового микроскопа.
    2. При большинство клеток появляются округлые или отдельно, добавляют 5 объемов (т.е. по сравнению с объемом трипсина добавленной) из подогретого полной EGM-2 среды и осторожно пипеткой по поверхности колбы, чтобы отделить все ячейки.
    3. Количество эндотелиальных клеток с помощью гемоцитометра, как описано в 1,6-1,7. Гранул клетки центрифугированием (5 мин, 1200 XG). Удалить супернатант. Регулировка концентрации 0,5 млн клеток на мл добавлением подогретого полной EGM-2 мВ сред.
    4. Передача аликвоты клеток в соответствующие FN-покрытием блюда или колбах для технического обслуживания. Аккуратно водоворот и поместить в инкубатор. Изменение информации в течение 6-12 ч обшивки. СМИ шоУльд быть изменены примерно каждый 48 ч после этого.

    4. эндотелиальных клеток Трансфекцию

    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичный эндотелиальные клетки невосприимчивыми к трансфекции наиболее распространенных химических и электропорации методов. Трансфекция основе метода ядерно описано ниже позволяет относительно высокой эффективности трансфекции (~ 50-70%). Эффективная альтернативный метод использования инфекции с помощью соответствующих вирусных векторов (см комментарии в таблице материалов).

    1. Подготовьте T25 или T75 колб (при необходимости) о HLMVECs или HDMVECs до конечной плотности 90-95% confluency.Coat с фибронектином (FN) 20ug / мл в PBS в стерильных условиях либо микроскопа культуральных планшетах, таких как дельта-Т пластин (для шаг 5) или 12 мм круглые покровные стекла помещают внутрь лунку планшета для культивирования клеток в 24-луночный (для стадии 6) с, как описано выше (2.1).
    2. Добавить 1 мл полной EGM-2 культуральной среде с микроскопом культуры platesor 0,5 мл в каждую лунку 24 и равновесие пластин вувлажненной 37 ° C / 5% CO 2 инкубаторе.
    3. Урожай и считать эндотелиальные клетки, как в шагах 3.1-3.3.Centrifuge необходимого объема клеток (0,5 млн клеток на образец) при 1200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл RT ядерного трансфекции раствора на образце.
    4. Смешайте 100 мкл клеточной суспензии с 1-5 мкг ДНК. Перевести клеток / подвеска ДНК в сертифицированных кювете; Образец должен покрыть дно кюветы без воздушных пузырьков.
      Примечание: Конструкции, направленные YFP или DsRed к клеточной мембране (через N-концевых 20 аминокислот neuromodulin, что содержит сигнал для посттрансляционной пальмитоилирование) были использованы в одиночку (одна мембрана-YFP или мембраной DsRed одна) или совместной трансфекции с цитоплазматическая объемная маркер (например, мембрана-YFP и растворимый DsRed). Многие перестановки флуоресцентный белок маркеров могут быть использованы.
    5. Закройте кювету крышкой. Вставьте кювету склеточной суспензии / ДНК в держатель кювет электропоратора и применять электропорации программы S-005. Возьмите кювету из держателя, как только программа закончена.
    6. Добавить ~ 500 мкл предварительно уравновешенную питательных сред в кювету и осторожно удалите клеточной суспензии из кюветы с использованием пластиковых пипеток трансфер предоставляется в комплекте ядерной трансфекции.
    7. Для экспериментов с использованием микроскопа культуры пластины разделить клеточную суспензию из одной реакции в равной степени между двумя блюд, содержащих подогретого СМИ (Шаги 4,2-4,3). Для экспериментов с использованием 24-луночного / плита, разделов одна реакция поровну между 3 скважин.
    8. Инкубируйте клетки в увлажненной 37 ° C / 5% CO 2 инкубаторе и замены среды 4-6 ч, и снова на 12-16 ч после трансфекции.

    5. живых изображений сотовый и анализ

    1. Подготовка эндотелия
      1. День 0: Со-трансфекции первичных HLMVECs с мембранного YFP и растворимого DsRed через nucleofeие технологии, как описано в шаге 4 и пластины на живой клеточной культуре изображений пластин.
      2. День 1: Заменить среды свежей средой, содержащей IFN-gamma (100 нг / мл), чтобы индуцировать экспрессию МНС-II. На 2-й день стимулировать трансфицированных клеток добавлением 20 нг / мл TNF-alpha к существующему сред.
      3. На 3 день, инкубировать эндотелий с 1 мкг / мл каждого из бактериальных суперантигенам стафилококковый энтеротоксин B (SEB) и токсин синдрома токсического шока 1 (TSST) при 37 ° C в течение 30-60 мин непосредственно перед экспериментами. Пропустите этот шаг для контрольных условиях "-ag '.
    2. Подготовка Лимфоциты
      1. Параллельно с шагом 5.1.3, готовят буфер А (без фенолового красного HBSS) с добавлением 20 мМ Hepes, рН 7,4, и 0,5% об / об человеческий сывороточный альбумин предварительно нагревают до 37 ° С. Возьмите образец культивируемых лимфоцитов и определить плотность путем подсчета с помощью гемоцитометра (этап 1.12-1.17).
      2. Центрифуга 2 млн клеток на образец на 1,200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре в 15 мл коническую пробирку. Аспирируйте СМИ и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера не такой, что никакая клетка кластеры остаются.
      3. Удалить свежий аликвоту Фура-2 красителя кальция и ресуспендируют в ДМСО, чтобы концентрация акций в 1 мм.
      4. Добавить 2 мкл фура-2 маточного раствора к суспензии клеток Т (2 мкМ конечная концентрация), крышка трубки и смешать сразу переворачивая пробирку, чтобы обеспечить равномерное диспергирование красителя. Выдержите в 37 ° C в течение 30 мин.
      5. Центрифуга, как в шаге 5.2.2. Аспирируйте буфера-А и мягко, но тщательно вновь переместить лимфоцитов в 20-40 мкл свежего буфера-А.
    3. Настройка изображений живых клеток и сбора
      Примечание: Большое разнообразие систем могут быть использованы для получения изображения живых клеток флуоресценции от вертикальных и перевернутых световых микроскопов. Основные требования включают в себя источник света флуоресценции и фильтров, ПЗС-камеры, моторизованные переключение фильтра и жалюзи, подогреваемый этап (или microscОПЕ-стойку с подогревом камера) и программного обеспечения для автоматизированного получения изображений. Для этого протокола высокой числовой апертурой, большим увеличением (т.е., 40х, 63x) масло погружения линзы, необходимое для достижения необходимого пространственного разрешения. Особое внимание должно быть принято в выборе соответствующего источника флуоресценции и линзы для визуализации Фура-2 на основе кальция, поскольку не все совместимы с необходимыми длинами волн возбуждения нм 340/380. Альтернативный подход (совместим со стандартными зеленого и красного наборов флуоресцентных фильтров) может быть использован с не-ratiomentic кальция чувствительных красителей (например, Fluo-4, Род-3), однако они не могут точно количественно поток кальция и только обеспечивают относительное / Количественный считывания.
      1. Включите систему микроскопа (ПК для работы, микроскопом, CCD камеры, фильтра колеса и ксеноновой лампы).
      2. Откройте обозначенный программного обеспечения.
      3. Настройте микроскоп / Программное обеспечение для автоматизированного многоканального покадровой съемки. Включить последовательную приобретение объявлениемifferential интерференционный контраст (DIC), стандартный зеленый флуоресцентный, стандартный красный светиться и стандартный возбуждения 340 нм и 380 Фура-2 изображения. Установите интервал для приобретения в течение 10-30 сек и общей длительностью ~ 20-60 мин.
        1. Установите время экспозиции для Фура-2 изображений.
          1. Добавить свежий объективный масло и смонтировать микроскопа блюдо, содержащее только 0,5 мл буфера-А на стадии нагрева адаптера и сразу включить, чтобы уравновесить до 37 ° С (будет ~ 2-3 мин).
          2. Добавить отдыхает фура2 загруженных лимфоцитов установленного микроскопа блюдо камеры с использованием 20 мкл пипетки.
          3. Включите изображений ярком поле. Выберите светлый путь к окуляров. Используйте грубую ручку фокусировки, чтобы принести цели в контакт с нижней части miscoscope блюдо. Используйте окуляр и мелкий ручку фокусировки, чтобы сфокусироваться на Т-клеток поселились на дно тарелки.
          4. Используйте элементы управления сценические ху выбрать поле, содержащее, по меньшей мере 10 ячеек. Избежатьпереполненных поля и клеточные скопления, как они будут создавать артефакты визуализации.
          5. Переход от светлого поля до Дневной источник света. Переход от изображения к окуляра CCD камеры. Установите параметры сбора (например, время экспозиции, усиления детектора и Биннинг). Использование программного обеспечения, приобретают отдыхает Fura2-340 и Fura2-380 изображений (начиная с одинаковым временем экспозиции для каждого, как правило, в диапазоне от ~ 200-1000 мс).
          6. С помощью методов, описанных в шаге 5.4.1 для расчета Fura2-340 / Fura2-380 для каждого лимфоцита. Выполните повторные итерации регулировки Fura2-340 и Fura2-380 время экспозиции, получения изображений и расчета коэффициентов, пока средние значения не близки к 1.
        2. Установите время экспозиции для MEM-YFP и DsRed.
          1. Замените микроскопа блюдо использовали в шаге 5.3.3.1 с miscroscope блюдо с трансфецировали, активированный и провисать лечение (или лечить; контроль) HLMVECs или HDMVECs из клеточной культуры инкубатор (этапы 4.5.1). Используйте одноразовые пипетки передачи для быстрого удаления СМИ, промыть один раз добавлением ~ 1 мл подогретого буферного-A. Аспирируйте, а затем добавить 0,5 мл буфера-А.
          2. Определить области, в которых ярко люминесцентные положительные трансфектант эндотелиальные клетки присутствуют и выглядят здоровыми с хорошо сформированными межклеточных соединений.
          3. Отрегулируйте параметры измерения (например, время экспозиции, усиления детектора и Биннинг) для MEM-YFP и DsRed. Убедитесь, что среднее значение интенсивности сигнала флуоресценции в каждом канале падает от 25% до 75% от динамического диапазона детектора.
      4. Провести эксперимент изображений живых клеток.
        1. Используйте автоматизированное программное обеспечение, чтобы начать сканирование изображения и захватить несколько интервалов изображений, чтобы установить базовый уровень.
        2. Во время приобретения применять ~ 5 мкл концентрированных Фура-2-нагруженных лимфоцитов (от шага 5.2) в центре поля изображения микроскопа блюдо, вставив кончик небольшой объем (Р-5или Р-20) пипетки в СМИ недалеко от центра объектива и выброса медленно.
        3. Как лимфоциты поселиться в области изображения, сделать тонкую настройку в фокусе, чтобы гарантировать, что интерфейс клеток клеток эндотелий Т (иммунологические синапсы) поддерживаются в фокальной плоскости. С 40 и 63x цели, ~ 10-20 клеток на поле, являются оптимальными. Если меньше клетки наблюдаются в повторите шаг поля изображения 5.3.4.2.
        4. После того, как требуемый интервал наблюдения эксперимента конкурировали, продолжают визуализации и немедленно пипеткой иономицином непосредственно в miscoscope блюдо (с использованием методики, как в 5.3.4.2) до конечной концентрации 2 мкМ, чтобы вызвать максимальный поток кальция / фура-2 сигнал сигнализации (т.е. , средства калибровки, см анализ 5.4.).
        5. В качестве альтернативы 5.3.4.4after желаемый интервал наблюдения эксперимента конкурировали, немедленно аспирации буфера A и заменить его 0,5 мл раствора (фиксатором 3,7% формальдегида в PBS) в течение 5 мин приРТ, последующей промывкой три раза PBS. Затем переходите к шагу 6.
    4. Анализ живых клеток изображений
      Примечание: После сохранения полученных файлов, они могут быть проанализированы непосредственно или экспортированы для анализа широкого спектра автономных программных приложений для анализа изображений. ImageJ является особенно ценным, универсальный пакет, который находится в свободном доступе и совместимо практически со всеми пакета программного обеспечения приобретение. Дизайн экспериментов изображений, описанных в шагах 5.1-5.3 даст высокую динамику пространственного и временного разрешения взаимодействий между лимфоцитами и эндотелиальной APC в отсутствие и в присутствии родственного SAg. Почти безграничные анализы возможны при решении визуализации данных динамики морфометрического / сигнальных клеточных. Конкретные цели, описанные в данном Протоколе координационно количественно миграции лимфоцитов и сигнализации (т.е., кинетика и уровни внутриклеточного кальция) потока наряду с динамичнымаль изменения в иммунологической синапса архитектуры с акцентом на особенностях (например, ILPs / Подо-печати). Следующие примеры отдельным стандартом и нестандартные (т.е., разработанный специально для этих экспериментов / вопросов) анализирует.
      1. Измерьте поток кальция лимфоцитов
        1. Выберите (нм EX-510 нм Е.М. 340) и Fura2-380 (380 нм EX-510 нм Е.М.) изображения начальная Fura2-340, которые были приобретены до добавления лимфоцитов. Используйте их в качестве фоновых изображений и цифровой вычесть их из всех изображений во временном ряду для каждого соответствующего канала.
        2. Для каждой временной точке создать отношение цифровое изображение фона вычитается Fura2-340 и фоновых вычитается Fura2-380 изображений (например, 340 нм EX-510 нм ЭМ-фон / 380 нм EX-510 нм ЭМ-фон).
        3. Выберите соответствующее программное обеспечение инструмент для рисования. Нажмите на экране, чтобы нарисовать круглую область Iпроценты (ROI) вокруг каждого лимфоцитов. Это будет генерировать значение отношения пиксела в среднем для каждого лимфоцитов и сроки.
        4. Участок вычисленное соотношение как функцию времени с использованием соответствующего программного приложения (например, электронную таблицу). Рассчитать усредненную поток кальция для эксперимента путем суммирования значения соотношения всех лимфоцитов в поле и что разделить стоимость на общее количество лимфоцитов в каждый момент времени
      2. Провести анализ lympocyte отслеживания миграции.
        1. Анализ Т-клеток миграции клеток с помощью соответствующего программного приложения для отслеживания клеток (например, ImageJ), используя канал DIC от каждого видео. Использование ImageJ сотовый отслеживания плагин, определить в каждом кадре центр тяжести каждой ячейки вручную, нажав на нее в каждом прогрессивный кадр.
        2. Используйте полученные координаты серийный ху (т.е. следы путей миграции), чтобы рассчитать среднюю скорость (общее расстояние мигрировали / общее интервал уплотнительноее томография) и извилистость (общее расстояние мигрировали / линейное расстояние конец в конец между расположением клеток в первом и последнем изображении).
        3. Кросс-коррелируют эти параметры с потоком кальция (5.4.1) динамики на основе клеток-за ячейкой.
      3. Оценить Подо-печати / ILP плотность в IS
        1. Граф общее количество ILP, образованную в каждом Т-клеток через определенные интервалы (например, 5 мин после добавления Т-клеток). Они могут быть определены дискретная микронных люминесцентные кольца мембраной YFP, что ко-локализуются с темными кругами в цитоплазматической DsRed на эндотелиальных APC на сайте лимфоцитов адгезии.
        2. Кросс-коррелируют полученные "ILP индексы" с потоком кальция (5.4.1) динамики на основе клеток-за ячейкой.
      4. Измерьте Подо-печать / ILP жизней.
        1. Для каждого Подо-печати / НРП в данном IS рассчитать свои жизней как последний момент времени, когда НРП была видна - момент времени, когда что-Подо печати / НРП фантастическиесначала появились. Средняя ИЛП времена жизни и за ЭТО.
        2. Кросс-соотнести эти жизней с потоком кальция (5.4.1) динамики на основе клеток-за ячейкой.
      5. Оценить временную связь между начального формирования ЦЛП и потока кальция.
        1. Для каждого лимфоцитов определить момент времени (кадра), в котором кальция сначала растет выше базового 19.
        2. Для каждого лимфоцитов определить момент времени, в который появляется первым Подо-печати / НРП.
        3. Для каждого лимфоцитов расчета "смещение времени" путем вычитания начального потока кальция момент времени от начальной Подо-печати / НРП. Средние значения для всех лимфоцитов в поле. Положительные значения указывают на формирование ИЛП предшествует поток кальция, тогда как отрицательные числа указывают на обратное.
          Примечание: Эти эксперименты могут быть легко осуществлены в соответствии с физиологически соответствующего ламинарного потока сдвига с использованием коммерчески доступных параллельных стенок камеры изображений потока, как описано 19.

    6. Исправлена-ячейки изображения и анализ

    1. Исправлена ​​конечная точка Т-клеток-эндотелиальной является формирование и окрашивание
      1. Подготовка Т-клеток, как описано в 1. Подготовьте эндотелиальные клетки (- / + SAG), как в шаге 5.1 (трансфекции Шаг 5.1.1 не является обязательным). Возьмите образец культивируемых лимфоцитов и определить плотность путем подсчета с помощью гемоцитометра (раздел 1).
      2. Передача культуры лимфоцитов объеме, эквивалентном не менее 3 х 10 5 лимфоцитов / образец на 15 мл коническую трубку и центрифуги при 200 мкг в течение 3 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок лимфоцитов в буферном-A (этап 5.2.1) концентрации 6 × 10 5 лимфоцитов / мл.
      3. Удалить эндотелиальные клетки из клеточной культуры инкубатор и (исходя один образец одновременно) последовательно аспирата материал и замените 0,5 мл суспензии лимфоцитов (3 х 10 5 лимфоцитов / образец) и заменить до 37 ° С яncubator.
      4. После соответствующих времени инкубации, было отмечено выше, аспирации среды из скважин и добавить достаточное Фиксирующий раствор (3,7% формальдегида в PBS), чтобы полностью покрыть образец (например, в 24-луночного планшета ~ 300-500 мкл). Выдержите при комнатной температуре в течение 5-10 мин.
      5. Промыть образец 3 раза ЗФР. Пятно добавлением первичного антитела в течение 60 мин при комнатной температуре (см список). Если первичное антитело направлено на внутриклеточного белка, дополнительный этап пермеабилизации должна быть выполнена при добавлении достаточного решение проницаемости (0,01% Тритон Х-100 в PBS), чтобы полностью покрыть образец в течение 1 мин при комнатной температуре. Промыть образец 3 раза ЗФР. Добавить соответствующие вторичные антитела (в некоторых случаях одновременно флуоресцентные фаллоидином) в течение 60 мин при комнатной температуре.
      6. Установите круглую стеклянную покровное на слайде формирования изображения. Исправлена ​​конечная точка Т-клеток-эндотелиальной является формирование и окрашивание. Для начала место визуализации изображений слайд, содержащий образцы на сцене микроскопа и выберите масло 63xзадача. Применить свежего иммерсионное масло.
    2. Используйте режим формирования ярко-поля и глазные линзы, чтобы определить местонахождение фокальной плоскости. Переключитесь на эпифлуоресцентной и осмотрите образец с помощью глазных линз. Выберите поле интересов. Переключение в режим лазерной сканирующей.
    3. Использование режима быстрого сканирования и работы в максимально возможной области индивидуально регулировать мощность лазера и коэффициент усиления для каждого канала, чтобы оптимизировать сигнал таким образом, что, в идеале, удельная интенсивность сигнала достигает, по меньшей мере ~ 25% и не более 75% от динамического диапазона детекторов.
    4. Использование ручного управления фокус, быстро сканировать через Z-оси и определить верхние и нижние пределы секционирования (как правило, вся информация должна содержаться в толщине ~ 15 мкм). Выбор толщины раздел оси Z. в диапазоне 0,2-1,0 мкм ~.
    5. Наконец, увеличение / обрезать поля изображения в конкретном регионе интересов и поведения сканирования. В дополнение к очень яркий и конкретный флуоресценции сигнал в образце, приобретая 3D-изображений в высоком разрешении требует итераций сканирования и внесения корректировок в параметры приобретения. Целью является для получения максимального ху и разрешение г-оси, без заметного фото-отбеливание.
    6. Качественно проанализировать топологию 3D топологии ИС путем проведения цифровой 3D-реконструкция в результате оптических срезов через соответствующее приложение программного обеспечения (например, изображения J). Через подобных приложений количественной оценки распределения сигнала флуоресценции (например, совместная локализация и интенсивность флуоресценции корреляционная линия сканирования анализ Пирсона и ортогональных просматривает).

    Результаты

    Подход изображений роман помощью эндотелиальных клеток и сочетая преимущества разрешением плоской липидного бислоя модели с физиологический сложности и деформации профессиональной БТР был разработан (рисунок 1). Рисунок 2 приведены примеры типичн...

    Обсуждение

    В целом, этот протокол описывает методы исследования эндотелиальные клетки, как я) изученных физиологических БТР и II) в качестве нового типа из "плоского клеточной модели APC». Что касается первого, то стал все более и более очевидно, что без гемопоэтических периферических (или «строма...

    Раскрытие информации

    The authors have nothing to disclose.

    Благодарности

    We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).

    Материалы

    NameCompanyCatalog NumberComments
    BD Vacutainer stretch latex free tourniquetBD Biosciences367203
    BD alcohol swabsBD Biosciences326895
    BD Vacutainer Safety-LokBD Biosciences367861K2 EDTA
    BD Vacutainer Push Button Blood Collection SetBD Biosciences367335
    RPMI-1640Sigma-AldrichR8758-1L
    Ficoll-PaqueSigma-AldrichGE17-1440-02Bring to RT before use
    FCS-OptimaAtlanta Biologicss12450Heat inactivated
    Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4458-100ML
    Trypan blueSigma-AldrichT8154-20ML
    staphylococcal enterotoxin BToxin TechnologyBT202REDStock solution 1mg/ml in PBS
    toxic shock syndrome toxin 1Toxin TechnologyTT606REDStock solution 1mg/ml in PBS
    human IL-15R&D Systems247-IL-025Stock solution 50ug/ml in PBS
    PBSLife Technologies10010-049
    FibronectinLife Technologies33016-015Stock solution 1mg/ml in H20
    HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo CellsLonzaCC-2543Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs
    EGM-2 MV bullet kitLonzaCC-3202
    Trypsin-EDTASigma-AldrichT-4174Stock solution 10x, dilute in PBS
    amaxa-HMVEC-L Nucleofector KitLonzavpb1003Required Kit for step 4
    IFN-gSigma-AldrichI3265Stock solution 1mg/ml in H20
    TNF-alpha 10ug, humanLife TechnologiesPHC3015Stock solution 1mg/ml in H20
    phenol Red-free HBSSLife Technologies14175-103
    HepesFisher ScientificBP299-100
    Calcium ChlorideSigma-AldrichC1016-100GStock solution 1M in H20
    Magnesium chlorideSigma-Aldrich208337Stock solution 1M in H20
    Human Serum albuminSigma-AldrichA6909-10ml
    Immersol 518 F fluorescence free Immersion oilFisher Scientific12-624-66A
    Fura-2 AM 20x50ugLife TechnologiesF1221Stock solution 1mM in DMSO
    pEYFP-Mem (Mem-YFP)Clontech6917-1
    pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed)Clontech632466
    pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)Clontech632512
    pEGFP-ActinClontech6116-1
    Alexa Fluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
    Formaldehyde solution 37%Fisher ScientificBP531-500Toxic, use fumehood
    Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML
     Falcon 15mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-70C
    Falcon 50mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-49A 
    Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25Fisher Scientific10-126-9
     Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75Fisher Scientific  13-680-65
     Corning Cell Culture Treated T175Fisher Scientific10-126-61 
    Glass coverslips Fisher Scientific12-545-85 12 mm diameter
     Falcon Tissue Culture Plates 24-wellFisher Scientific08-772-1
    Delta-T platesBioptechs04200415B
    Wheaton Disposable Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-8D
    1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific05-402-25
     ICAM1 mouse anti-humanBD Biosciences555509
    HS1 mouse anti-humanBD Biosciences610541
    Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) PurifiedebioscienceBMS102
    Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488ebioscience53-0037-41
    Anti-MHC Class II antibody Abcamab55152
    Anti-Talin 1 antibodyAbcamab71333
    Anti-PKC theta antibody Abcamab109481
    phosphotyrosine (4G10 Platinum)Millipore50-171-463
    Nucleofector IIAmaxa BiosystemsRequired electroporator for step 4
    Zeiss AxiovertCarl Zeiss MicroImaging
    Zeiss LSM510 Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss Axiovison SoftwareCarl Zeiss MicroImaging
    NU-425 (Series 60) Biological Safety CabinetNuAIRENu-425-600
     Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture IncubatorFisher Scientific202370
    Centrifuge 5810EppendorfEW-02570-02
    HemocytometerSigma-Aldrich Z359629Bright-Line Hemocytometer
    Isotemp Waterbath model 202Fisher Scientific15-462-2

    Ссылки

    1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
    2. Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
    3. Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
    4. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
    5. Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
    6. Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
    7. Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
    8. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
    9. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
    10. Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
    11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
    12. Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
    13. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
    14. Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
    15. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
    16. Martinelli, R., Carman, C. V., Bradshaw, R. A., Stahl, P. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. , (2015).
    17. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
    18. Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?. Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
    19. Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
    20. Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
    21. Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
    22. Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
    23. Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
    24. Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
    25. Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
    26. Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
    27. Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
    28. Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
    29. Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
    30. Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
    31. Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
    32. Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
    33. Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
    34. Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
    35. Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
    36. Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
    37. Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

    Запросить разрешение

    Смотреть дополнительные статьи

    106

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

    РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

    НОВОСТИ JoVE

    Исследования

    Образование

    АВТОРЫ

    Библиотекарь

    О JoVE

    Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены