JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем программируемый лабораторный прибор, который может использоваться для создания экстракты обычных сигарет курить и электронных сигарет аэрозоля. Этот метод предоставляет полезный инструмент для прямых сравнений между обычные сигареты и электронные сигареты и является доступной точки входа в электронных сигарет исследований.

Аннотация

Электронные сигареты являются наиболее популярные виды табачной продукции среди среднего и школьников и наиболее популярных альтернативной табачной продукции среди взрослых. Высокое качество, воспроизводимости исследований о последствиях использования электронных сигарет имеет важное значение для понимания возникающих проблем общественного здравоохранения и выработке доказательств на основе политики регулирования. Хотя все большее число документов обсуждать электронные сигареты, существует мало согласованности в методах различных групп и очень мало консенсуса по результатам. Здесь мы описываем программируемый лабораторный прибор, который может использоваться для создания экстракты обычных сигарет курить и электронных сигарет аэрозоля. Этот протокол детали инструкции по сборке и эксплуатации сказал устройства и демонстрирует использование созданного экстракт в двух образцов приложений: в пробирке жизнеспособности assay клетки и газовой хроматографии масс спектрометрии. Этот метод предоставляет средство для прямых сравнений между обычные сигареты и электронные сигареты и является доступной точки входа в электронных сигарет исследований.

Введение

Несмотря на концентрированные усилия организаций здравоохранения продуктов табака остается ведущей причиной предотвратимой смертности во всем мире, причем большинство этих смертей, приписываемых сигарет для некурящих1. С момента выхода на рынок в 2003 году, электронные сигареты растет в популярности среди пользователей продуктов табака. В настоящее время электронные сигареты являются наиболее популярной альтернативой обычных сигарет среди взрослых американцев (~ 5%)2 и наиболее популярные системы доставки никотина среди среднего (~ 5.3%) и школьников (~ 16%)3. Если нынешние тенденции сохранятся, электронные сигареты можно ожидать заменить обычные сигареты для будущих поколений. Однако последствия использования электронных сигарет для здоровья остаются неясными.

Исследования на электронные сигареты не начинал всерьез до тех пор, пока электронная сигарета популярность резко возросла в 20133,4. С того времени целый ряд различных моделей были использованы для решения вопроса об их токсичности. Однако результаты многих исследований противоречивые, и хотя кажется, что электронные сигареты являются как правило менее токсичен, чем обычные сигареты, существует не нынешний консенсус на последствия для здоровья электронная сигарета использовать5, 6 , 7. наши предыдущие исследования показывают, что электронные сигареты являются значительно менее токсичен для сосудистого эндотелия, чем обычные сигареты, несмотря на их способность вызывать повреждение ДНК и индукции окислительного стресса и клеток смерть8 . Однако дополнительные исследования необходимо прежде, чем мы можем сделать твердые выводы о последствиях для здоровья использования электронных сигарет.

Как обычные сигареты являются ведущей причиной болезней сосудистой9, существует растущий интерес к сосудистого здоровья риска электронная сигарета использовать10,,1112. С целью изучения воздействия электронных сигарет на сердечно-сосудистой системы, нашей лаборатории разработан микроконтроллер работает для некурящих/vaping устройства (рис. 1)8. Этот прибор способен генерировать жидких экстрактов либо обычных сигарет курить или электронная сигарета аэрозоля в водном или органических растворителях. Как поток воздуха контролируется сочетание регулируемый регулятор потока и времени программы PBASIC, устройство может использоваться для создания экстрактов согласно любое количество пользовательских протоколов. Здесь мы подробно, сборке и эксплуатации этого устройства, а также два потенциальных применений: в пробирке оценки жизнеспособности клеток и газовая хроматография, масс спектрометрии.

figure-introduction-3142
Рисунок 1: устройство для некурящих/Vaping. Схема физической Ассамблее для некурящих/vaping устройства в сигарет/сигарет как электронные сигареты (e-cig) конфигурации (A) и бак электронная сигарета конфигурации (B). Ключевых компонентов: 1) ингаляции порт; 2) Основная коллекция Импинджера; 3) переполнения Импинджера; 4) Buchner Склянка вакуума ловушки; 5) нормально открытый электромагнитный клапан; 6) BS1 микроконтроллер; 7) Регулятор потока воздуха; 8) 510 резьбовые электронная сигарета танк базы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

протокол

1. Ассамблея устройства

  1. Безопасный 100 мл Buchner колбу (рис. 1, #4) к стальное кольцо стоять и создать вакуум ловушку, заполнив его с 50 г хлорида кальция в качестве осушитель. Уплотнение колбу с резиновой пробкой через отверстие, завернуть пробку пересечения с парафином фильм и запустить пипеткой через отверстие.
  2. Используя виниловые трубки, подключите пипетки, простирающейся от пробку на т-образном пересечении шланга.
  3. Используя виниловые трубки, соединиться друг с другом два Импинджера (рис. 1, #2 и #3) и соедините выход второго Импинджера к разъему шланг т-образном пересечении.
  4. Используя виниловые трубки, подключите порт ввода первого Импинджера служить порт ингаляции (рис. 1, #1).
  5. Используя виниловые трубки, подключите сторону руку настой по Buchner к порт ввода воздуха регулятора (рис. 1, #7) и порт выхода регулятора воздуха для вакуумного насоса.
  6. Соберите цепь по схеме на рисунке 2A.
  7. Загрузите программу PBASIC SVL.bs1 (рис. 2B, также доступны на https://github.com/ChastainAnderson/SVL) к микроконтроллеру BS1 (рис. 1, #6) с помощью последовательный адаптер и программное обеспечение производителя.
  8. Место 510 резьбовые база (рис. 1 #8) в кольце стоять зажим.
  9. Используя виниловые трубки, подключите к свободный конец шланга т-образном пересечении электромагнитный клапан (рис. 1, #5).
    Примечание: Устройство должно быть полным и готов к эксплуатации, проверьте все соединения, чтобы убедиться, что они являются герметичность и применяются хомуты и вакуумные смазка при необходимости.

figure-protocol-1958
Рисунок 2: электрические схемы и PBASIC код. Рисунок 2A отображает электрические схемы для монтажа электрической цепи, необходимо активировать нормально открытый электромагнитный клапан и отопление катушки кнопки активации электронных сигарет (через 510 резьбовые электронных сигарета танк база). Электрические параметры Отопление катушки (P: мощность; R: сопротивления; и ток I:) прогнозируется и должны быть проверены эмпирически с мультиметр пост Ассамблеи. Рисунок 2B отображает программу PBASIC сроков, необходимых для контроля цепи в рисунок 2A (также доступно в https://github.com/ChastainAnderson/SVL). Константы времени СВТ и IPT (#5 и #6) в единицах ms и установлены для обеспечения активации время 2 секунды и простоя 28 s. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. образец хранения и подготовки

  1. Храните все образцы закрытой обычных и электронных сигарет в темноте в герметичные пластиковые мешки при комнатной температуре.
  2. После вскрытия Храните образцы в герметичные пластиковые мешки на 4 ° c, чтобы поглощать избыточную влагу бумажным полотенцем.
  3. Предварительно сбалансировать все образцы в комнатной температуре хьюмидор в ~ 60% влажности для по крайней мере 30 минут до использования.

3. Общие операции сигаретного дыма/электронная сигарета аэрозоля извлечения устройства

  1. Определите массу каждого e сигареты Картомайзер/танк pre-vaping с помощью аналитического баланса. Разница в весе pre/после после vaping будет использоваться для определения соответствующей дозировки.
    Примечание: предполагается, что 3R4F ссылка сигареты содержат 0,7 мг никотина, и содержание никотина сигареты коммерческих брендов могут определяться обычные аналитические методы13.
  2. Для образца приложения 1 Заполните резервуар первичного Импинджера с 4.3 мл эндотелиальных клеток питательной среды. Для образца приложения 2 Заполните резервуар с 5 мл ацетона.
  3. Подготовка электронных сигарет или обычных сигарет для извлечения:
    1. При использовании обычных сигарет, применить кусок прозрачной клейкой ленты вокруг фильтра и положить легко видимый знак, где папиросной бумаги присоединяется к фильтр.
    2. При использовании сигареты как e сигареты, убедитесь также зарядки и Картомайзер плотно привинчен к аккумуляторной батарее.
    3. При использовании электронных сигарет танк, убедитесь, что соответствующий объем жидкости для электронных сигарет загружается в баке и винт танк на базе 510 резьбовые.
  4. Вставьте наконечник обычных или электронных сигарет в порт ингаляции (рис. 1, #1) и закрепите зажим шланга.
  5. Включите вакуумный насос.
  6. Отрегулируйте расходомер тянуть 1,65 Л/мин для обеспечения 55 мл слоеного более 2 секунд.
  7. Включите микроконтроллера. При использовании обычных сигарет, легкие сигареты на первой слойка.
  8. Запуск до прогнозируемых желаемой концентрации (в частях на миллион или % вес/объем) достигается.
  9. Определите массу каждый Картомайзер/танк e сигареты после испарения, используя аналитический баланс. Сравните этот измерения для измерения, сделанной в шаге 3.1 для определения общей массы потребляемых. Рассчитайте концентрацию потребляемого масса/объем растворителя. Используйте Молярная концентрация потребления никотина для нормализации между продуктами.
    1. Если потребляется недостаточно массы, вернуть устройство электронных сигарет и потребляют далее.
    2. Если потребляется достаточное или избыток массы, продолжить.

4. фильтрации и хранения

  1. Если экстракт должна использоваться для культуры клеток, процеживают через шприц фильтр PES 0,22 мкм.
  2. Используйте экстракты сразу или хранить при температуре-80 °. В рамках подготовки к Андерсон, и др. 8, электронная сигарета аэрозоля был продемонстрирован быть стабильным в течение двух недель, и стабильности сигаретного дыма на срок до двух лет был создан мошенников, и др. 13.

5. Очистка устройства

  1. После каждого извлечения промойте трубы и водохранилищ устройства с 70% этанола и обессоленной воды, чтобы предотвратить переносить между выборками.
  2. После ополаскивания, кратко запустить пустое устройство для воздуха для оказания помощи сушки линий.

6. пример приложения 1: Нейтральный красный поглощение жизнеспособности Assay клетки

  1. Выполнения извлечения как указано выше в 4.3 мл средний рост эндотелиальных клеток.
  2. Один день до, семян эндотелиальных клеток человека пупочную вену в 96 хорошо пластины на плотности 1 х 104 клетки/wellin 100 мкл средний рост эндотелиальных клеток.
  3. Лечить клетки, заменив старый эндотелиальных клеток питательной среды либо 100 мкл свежие эндотелиальных клеток питательной среды в качестве элемента управления или 75 мкл среднего роста эндотелиальных клеток, смешанного с 25 мкл концентрированного экстракта концентрации никотина потребляется 2 мм (1,4 мг потребления никотина в 4.3 мл средний рост эндотелиальных клеток) для окончательного концентрации 500 мкм в качестве лечения.
  4. Как многие из компонентов обеих аэрозоля дыма и электронные сигареты сигареты изменчивы, используйте печать фольгой держать скважин герметичной.
  5. Инкубировать пластину 18 – 24 часа при 37 ° C и 5% CO2.
  6. Подготовьте нейтральный красное окрашивание раствора:
    1. Создание 100 x нейтральных красный акций решения путем растворения 33 мг нейтрального красного красителя в 10 мл буфферезированный раствор соли.
    2. Незадолго до использования разбавляют 100 x Стоковый раствор 1: 100 в ячейке питательной среды для создания 1 x нейтрального красного окрашивания раствора.
    3. Инкубируйте нейтральных красное окрашивание раствора при 37 ° C для по крайней мере 30 минут до использования и использования немедленно.
      Примечание: Это нормально для некоторых кристаллов, чтобы осадок во время инкубации. Следует позаботиться о том, чтобы избежать применения этих кристаллов к скважинам культуры клеток. При необходимости,.22 мкм фильтр может использоваться для фильтрации нейтральным красным фондовых и окрашивание решения.
  7. Удаление экстракт и 100 мкл нейтральных красное окрашивание раствора в хорошо, использование избыточного для создания по крайней мере три пустые скважин для надлежащей количественной оценки.
  8. Инкубируйте пластину на 2-4 ч при 37 ° C и 5% CO2.
  9. Удаление нейтрального красного окрашивания раствора и промыть 3 x погружение в PBS.
  10. Применение нейтрального Красного де пятно решение (50% деионизированная вода, 49% этанола, 1% уксусной кислоты).
  11. Инкубируйте по крайней мере 10 мин при комнатной температуре при встряхивании.
  12. Читайте поглощения на 540 Нм.
  13. Анализ данных путем вычитания из среднее значение пустой скважин и нормализации в среднем хорошо значение пустой скорректированные управления.

7. пример приложения 2: газовая хроматография, масс-спектрометрия

  1. Выполняйте извлечение как выше в 5 мл ацетона.
  2. Запуск устройства для достижения конечной концентрации ~ 100 частей на миллион (вес объема e жидкость потребляется/ацетон) вашего образца.
  3. С помощью шприца точности стекла, inject 1 мкл в инжектор устройство GC-MS. Залить на 250 ° C с 1:20 разделить система спаренных газовый хроматограф/квадрупольного спектрометр с ZB-5 столбец с следующий протокол печь соотношение: 1 мин при 50 ° C; рампа 10 ° C/мин до 140 ° C; рампа 20 ° C/мин до 300 ° C и удерживайте в течение 10 мин.
  4. Матч результате массового спектры для целевой библиотеки для идентификации компонентов аэрозоля.

Результаты

В течение 24 часов облучения человека пупочную вену эндотелиальных клеток для обычных сигаретный дым экстракт (CSE) или электронная сигарета аэрозоля экстракт (EAE), существует значительная (управления против CSE P < 0,001; управления против ЕАЕ P < 0,01; n = 6) снижение жиз?...

Обсуждение

Наиболее важных элементов этого протокола являются обеспечение того, что устройство является чистым в начале и окончания каждого добычи, и обеспечение того, чтобы все уплотнения так что воздушный поток остается последовательной. Если устройство не очищены, существует риск переноса на...

Раскрытие информации

Программа табака продукта регулирования науки исследовательских стипендий, ведении Тулейнский университет финансируется Altria клиента служб регулирования дел.

Благодарности

Авторы признают помощи д-р Роберт Dotson Tulane университета Департамента клеточной и молекулярной биологии за его помощь в редактировании рукописи и д-р Джеймс Bollinger Тулейнский университет Кафедра химии за его помощь с протокол дизайн масс-спектрометрии. Далее авторы признают Tulane университета Департамента клеточной и молекулярной биологии и Тулейнский университет Кафедра химии для их поддержки и использования пространства и оборудования. Эта работа была поддержана стипендии исследований табак продукта регулирования науки к. Андерсон из Tulane университета школа науки и техники.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12 V AC/DC Wall Mount AdaptorDigi-KeyT1099-P5P-ND
2.2 Ohm ResistorsDigi-KeyA105635-NDUsed in tandem to generate the 4.4 Ohm resistance in Figure 2A
330 Ohm ResistorsDigi-Key330QBK-ND
510 Threaded BaseNJoyN/ARecovered by dismantalling a second generation NJoy electronic cigarette
Acetic Acid, GlacialSigma-AldritchA6283
Acetone (Chromatography Grade)Sigma-Aldritch34850
Basic Stamp Project BoardDigi-Key27112-NDThis board contains the BS1 Microcontroller, serial adaptor, power switch, and a barrel pin connector for the AC/DC Wall Mount Adaptor
Basic Stamp USB to Serial AdapterDigi-Key28030-NDAn optional component to allow the BS1 serial adaptor to communicate through USB
Buchner Flask (Vacuum Flask) 250 mLVWR10545-854
Clear Tape3MS-9783
Clear Vinyl Tubing, 3/8" IDWatts443064
EGM-2 Endothelial Cell Culture MediumLonzaCC-3162
EthanolPharmco-Aaper111000200
Flow RegulatorDwyerVFA-23-BV
Gas ChromatographVarian450-GC
Glass Syringe, 10 mLSigma-AldritchZ314552
Glass Syringe, 10 µLHamilton80300
High Vacuum Silicon GreaseDow Corning146355D
Hose ClampPrecision Brand35125
Human Umbilical Vein Endothelial CellsATCCPCS-100-013 
Mass SpectrometerVarian300-MS
Midget ImpingerChemglassCG-1820-01
Neutral RedSigma-AldritchN4638
Paraffin Film3MPM-992
Plate Seal RollerBioRadMSR0001
Plate Seal; FoilThermo276014
Ring Stand 20"American Educational Products7-G15-A
Solenoid Valve (normally open)US SolidUSS2-00081
Solid State RelayDigi-KeyCLA279-ND
Stand ClampEiscoCH0688
Syringe Filter, PES, 0.22 umMilliporeSLGP033RS
Syringe, 10 mLBD Syringe309604
Through Hole Stopper, Size 6VWR59581-287
Vacuum PumpKNF NeubergerN86KTP

Ссылки

  1. World Health Organization. . WHO Report on the Global Tobacco Epidemic, 2011. , (2011).
  2. Weaver, S. R., Majeed, B. A., Pechacek, T. F., Nyman, A. L., Gregory, K. R., Eriksen, M. P. Use of electronic nicotine delivery systems and other tobacco products among USA adults, 2014: results from a national survey. Int. J. Public Health. 61 (2), 177-188 (2016).
  3. Singh, T., et al. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011–2015. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 65 (14), 361-367 (2016).
  4. Corey, C. G., Ambrose, B. K., Apelberg, B. J., King, B. A. Flavored Tobacco Product Use Among Middle and High School Students--United States, 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 64 (38), 1066-1070 (2015).
  5. Pisinger, C., Døssing, M. A systematic review of health effects of electronic cigarettes. Prev. Med. 69, 248-260 (2014).
  6. Callahan-Lyon, P. Electronic cigarettes: human health effects. Tob. Control. 23 (Suppl 2), ii36-ii40 (2014).
  7. Dinakar, C., O'Connor, G. T. The Health Effects of Electronic Cigarettes. N. Engl. J. Med. 375 (14), 1372-1381 (2016).
  8. Anderson, C., Majeste, A., Hanus, J., Wang, S. E-cigarette aerosol exposure induces reactive oxygen species, DNA damage, and cell death in vascular endothelial cells. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. , (2016).
  9. U.S. Department of Health and Human Services. . The Health Consequences of Smoking: 50 Years of Progress. A Report of the Surgeon General. , (2014).
  10. Farsalinos, K., et al. Comparison of the Cytotoxic Potential of Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Vapour Extract on Cultured Myocardial Cells. Int. J. Environ. Res. Public. Health. 10 (10), 5146-5162 (2013).
  11. Schweitzer, K. S., et al. Endothelial disruptive proinflammatory effects of nicotine and e-cigarette vapor exposures. Am. J. Physiol. - Lung Cell. Mol. Physiol. 309 (2), L175-L187 (2015).
  12. Putzhammer, R., et al. Vapours of US and EU Market Leader Electronic Cigarette Brands and Liquids Are Cytotoxic for Human Vascular Endothelial Cells. PLOS ONE. 11 (6), e0157337 (2016).
  13. Crooks, I., Dillon, D. M., Scott, J. K., Ballantyne, M., Meredith, C. The effect of long term storage on tobacco smoke particulate matter in in vitro genotoxicity and cytotoxicity assays. Regul. Toxicol. Pharmacol. 65 (2), 196-200 (2013).
  14. Roemer, E., et al. Mainstream Smoke Chemistry and in Vitro and In Vivo Toxicity of the Reference Cigarettes 3R4F and 2R4F. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 25 (1), (2014).
  15. International Organization for Standards. . ISO 3088:2012 Routine analytical cigarette smoking machine – Definitions and standard conditions. , (2012).
  16. World Health Organization. . Standard Operating Procedure for Intense Smoking of Cigarettes. , (2012).
  17. Brown, C. J., Cheng, J. M. Electronic cigarettes: product characterisation and design considerations. Tob. Control. 23 (Suppl 2), ii4-ii10 (2014).
  18. Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco. . CRM No. 81 - Routine Analytical Machine for E-Cigarette Aerosol Generation and Collection - Definitions and Standard Conditions. , (2015).
  19. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Exp. Toxicol. Pathol. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  20. Klus, H., Boenke-Nimphius, B., Müller, L. Cigarette Mainstream Smoke: The Evolution of Methods and Devices for Generation, Exposure and Collection. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 27 (4), (2016).
  21. Baker, R. The Development and Significance of Standards for Smoking-Machine Methodology. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 20 (1), (2014).
  22. Thorne, D., Crooks, I., Hollings, M., Seymour, A., Meredith, C., Gaca, M. The mutagenic assessment of an electronic-cigarette and reference cigarette smoke using the Ames assay in strains TA98 and TA100. Mutat. Res. Toxicol. Environ. Mutagen. 812, 29-38 (2016).
  23. Thorne, D., Larard, S., Baxter, A., Meredith, C., Gaҫa, M. The comparative in vitro assessment of e-cigarette and cigarette smoke aerosols using the γH2AX assay and applied dose measurements. Toxicol. Lett. 265, 170-178 (2017).
  24. Herrington, J. S., Myers, C. Electronic cigarette solutions and resultant aerosol profiles. J. Chromatogr. A. 1418, 192-199 (2015).
  25. Yu, V., et al. Electronic cigarettes induce DNA strand breaks and cell death independently of nicotine in cell lines. Oral Oncol. 52, 58-65 (2016).
  26. Ji, E. H., et al. Characterization of Electronic Cigarette Aerosol and Its Induction of Oxidative Stress Response in Oral Keratinocytes. PLOS ONE. 11 (5), e0154447 (2016).
  27. Morgan, D. L., et al. Chemical Reactivity and Respiratory Toxicity of the -Diketone Flavoring Agents: 2,3-Butanedione, 2,3-Pentanedione, and 2,3-Hexanedione. Toxicol. Pathol. 44 (5), 763-783 (2016).
  28. Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco. . CRM No. 84 - Determination of Glycerin, Propylene Glycol, Water, and Nicotine in the Aerosol of E-Cigarettes by Gas Chromatographic Analysis. , (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131Vaping

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены