전통적인 담배 연기와 전자 담배 연 무질에서 액체 추출의 세대에 대 한 장치를 운영 하는 마이크로컨트롤러

요약

여기, 우리는 기존의 담배 연기 및 전자 담배에 어로 졸의 추출 물을 만드는 데 사용할 수 있는 프로그래밍 가능한 실험실 장치를 설명 합니다. 이 메서드는 일반 담배와 전자 담배 사이의 직접 비교를 하기 위한 유용한 도구를 제공 하며 전자 담배 연구를 액세스할 수 있는 진입점입니다.

초록

전자 담배 중, 고 등 학생 중에서 가장 인기 있는 담배 제품 이며 성인 중 가장 인기 있는 대체 담배 제품. 높은 품질, 전자 담배 사용의 결과 대 한 재현성 연구 공중 보건 우려 신흥 및 증거를 만들어 규제 정책을 기반으로 하는 이해를 위해 필수적 이다. 전자 담배, 논의 하는 논문의 수가 증가 하는 동안 약간의 일관성에에서 있다 방법 그룹 및 결과에 거의 합의. 여기, 우리는 기존의 담배 연기 및 전자 담배에 어로 졸의 추출 물을 만드는 데 사용할 수 있는 프로그래밍 가능한 실험실 장치를 설명 합니다. 이 프로토콜 어셈블리 및 했다 장치의 운영에 대 한 지침을 자세히 설명 하 고 두 샘플 응용 프로그램에서 생성 된 추출의 사용 방법을 보여 줍니다: 체 외에서 세포 생존 능력 분석 실험 및 가스 크로마토그래피 질량 분석. 이 메서드는 일반 담배와 전자 담배 사이의 직접 비교를 만들기 위한 도구를 제공 하며 전자 담배 연구를 액세스할 수 있는 진입점입니다.

서문

건강 기관에 의해 집중적인된 노력에도 불구 하 고 사용 하는 담배 제품 담배 흡연¹기인이 죽음의 대다수와 가진 전세계 예방 가능한 사망의 주요 원인이 남아 있습니다. 이후 2003 년에 시장에 진입, 전자 담배는 담배 제품 사용자 들 사이 인기가 증가 되었습니다. 현재, 전자 담배는 일반 담배 미국 성인 (~ 5%)² 중 고 중 (~ 5.3%), 고 등 학생 (~ 16%)³중 가장 인기 있는 니코틴 전달 시스템을 가장 인기 있는 대안 이다. 현재 추세가 계속 하는 경우 전자 담배 미래 세대에 대 한 일반 담배를 대체 하 예상 될 수 있다. 그러나, 전자 담배 사용의 건강 결과 불분명 남아 있습니다.

전자 담배에 대 한 연구는 전자 담배 인기 2013^3,4에 급속 하 게 증가 될 때까지 본격적으로 시작 하지 않았다. 그때 이후로, 다른 모델의 숫자는 그들의 독성의 문제를 해결 하기 위해 고용 되었다. 그러나, 많은 연구의 결과 충돌, 있으며 전자 담배는 일반 담배 보다 일반적으로 덜 독성 것 같다 동안 전자 담배 건강 결과에 아무 현재 일치^{5, 6 , 7}. 우리의 이전 연구는 전자 담배는 DNA 손상 및 산화 스트레스와 세포 죽음^{8의 유도 원인 그들의 능력에도 불구 하 고 일반 담배 보다 훨씬 적은 혈관 내 피에 독성을 나타냅니다} . 그러나 전자 담배 사용의 건강 결과 대 한 확고 한 결론을 내릴 수 있습니다 전에, 더 많은 연구가 필요 하다.

일반 담배는 혈관 질환 예방⁹의 주요 원인,^10,,1112를 사용 하는 전자 담배 혈관 건강 위험에는 관심이 있다. 혈관 시스템에 전자 담배의 효과 공부 하기 위하여 우리의 실험실 개발 운영 마이크로컨트롤러 흡연/vaping 장치 (그림 1)⁸. 이 장치는 수성 또는 유기 용 매에 액체 추출 하거나 기존의 담배 연기 또는 전자 담배에 어로 졸의 생성 수 있습니다. 공기는 조절 가능한 공기 흐름 레 귤 레이 터 및 PBASIC 타이밍 프로그램의 조합에 의해 제어 됩니다로 여러 사용자 정의 프로토콜에 따라 추출 물 생성 하 장치를 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 세부 어셈블리 및이 장치 뿐만 아니라 2 개의 잠재적인 응용 프로그램의 작동: 체 외에서 세포 생존 능력 평가 및 가스 크로마토그래피 질량 분석.

그림 1: 금연/Vaping 장치. 전자 담배 (전자-cig) 구성 (A) 처럼 담배/담배와 탱크 전자 담배 구성 (B) 흡연/vaping 장치의 실제 어셈블리에 대 한 도식 구성 요소 키: 1) 흡입 포트; 2) 기본 컬렉션 임 핀 저; 3) 오버플로 임 핀 저; 부 흐 너 4) 플라스 크 진공 트랩; 5) 일반적으로 열려 솔레노이드 밸브; 6) BS1 마이크로컨트롤러; 7) 공기 밸브; 8) 510 전자 담배 탱크 기본 스레드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

1입니다. 조립 장치

1. 부 흐 너 플라스 크 (그림 1, #4) 강철 반지를 고를 건조 시키는 역할을 염화 칼슘의 50 g 그것을 작성 하 여 진공 트랩을 만들 100 mL를 보안 합니다. 고무를 통해 구멍 마 개와 함께 플라스 크를 밀봉 하 고 파라핀 필름, 마 개 접합 랩 구멍을 통해 한 피 펫을 실행 합니다.
2. 비닐 튜브를 사용 하 여 t-교차점 호스 커넥터 마 개에서까지 피 펫을 연결 합니다.
3. 비닐 튜브를 사용 하 여 두 임 핀 저 (그림 1, # 2와 #3)에 연결 하 고 출력을 연결 합니다 두 번째 임 핀 저의 t-교차점 호스 커넥터.
4. 비닐 튜브를 사용 하 여 흡입 포트 (그림 1, #1)로 첫 번째 임 핀 저의 입력된 포트를 연결 합니다.
5. 부 흐 너 플라스 크의 측면 팔 공기 레 귤 레이 터 (그림 1, #7)의 입력된 포트에 연결 하는 비닐 튜브를 사용 하 여 고 진공 펌프 공기 레 귤 레이 터의 출구 포트.
6. 그림 2A에서 회로도 따라 회로 조립 한다.
7. 직렬 어댑터 및 제조업체의 소프트웨어에 의하여 BS1 마이크로컨트롤러 (그림 1, #6)를 PBASIC 프로그램 SVL.bs1 (그림 2B, 또한 https://github.com/ChastainAnderson/SVL에서 제공)를 업로드 합니다.
8. 장소는 510 스레드 자료 (그림 1 #8) 링에 서 클램프.
9. 비닐 튜브를 사용 하 여 t-교차점 호스 커넥터의 자유로운 끝에 솔레노이드 밸브 (그림 1, #5)를 연결 합니다.
   참고: 장치 완료 하 고 작업에 대 한 준비, 그들은 공기가 꽉 이며 호스 클램프 및 필요에 따라 진공 그리스 적용 되도록 모든 관절을 확인 한다.

그림 2: 전기 회로도 및 PBASIC 코드. 그림 2A 모두 정상적으로 열려 솔레노이드 밸브를 활성화 하는 데 필요한 전기 회로 조립 전기 회로도 표시 하 고 버튼의 난방 코일 활성화 전자 담배 (는 510 통해 스레드 전자 담배 탱크 기본)입니다. 난방 코일 (p: 전력;의 전기 매개 변수 R: 저항; 그리고 i: 전류)는 예상 하 고 경험적으로 멀티 미터 게시물 어셈블리 확인 되어야 한다. 그림 2B PBASIC 타이밍 프로그램을 그림 2A (또한 https://github.com/ChastainAnderson/SVL에서 제공)에 회로 제어 하는 데 필요한 표시 됩니다. SVT & IPT (#5 & #6) 타이밍 상수 ms의 단위에는 및 2 초 활성화 시간과 28의 가동 중지 시간을 제공 하기 위해 설정 s. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 샘플 저장 및 준비

1. 실내 온도에 완벽 한 비닐 봉투에 어둠 속에서 모든 개봉된 전통과 전자 담배 샘플을 저장 합니다.
2. 일단, 과도 일 분을 흡수 하는 종이 타월로 4 º C에서 밀폐 비닐 봉지에 샘플을 저장 합니다.
3. 미리 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 실내 온도 humidor 습도 ~ 60%에서 모든 샘플을 equilibrate.

3. 일반 동작 담배 연기/전자 담배 졸 추출

1. 각 전자 담배 cartomizer/탱크 사전-vaping 분석 균형을 사용 하 여의 질량을 결정 합니다. 사전/사후 사후 vaping 무게의 차이 적절 한 투약을 결정 하기 위해 사용 됩니다.
   참고: 3R4F 참조 담배 니코틴, 0.7 mg를 포함로 간주 됩니다 그리고 상업 담배 상표의 니코틴 내용 기존의 분석 방법¹³에 의해 결정 될 수 있다.
2. 샘플 응용 프로그램 1에 대 한 기본 임 핀 저 저수지 내 피 세포 배양 매체의 4.3 mL 채워 놓습니다. 샘플 응용 프로그램 2, 아세톤의 5 mL로 저수지를 채우십시오.
3. 전자 담배 또는 기존의 담배 추출에 대 한 준비:
   1. 기존의 담배를 사용 하는 경우 필터 주위 명확한 테이프의 조각을 적용 하 고 담배 종이 필터를 조인 쉽게 표시 마크를 넣어.
   2. 전자 담배 처럼 담배를 사용 하 여 확인 하는 경우 배터리가 충전 잘 하 고는 cartomizer 배터리 단단히 조여.
   3. 전자 담배 탱크를 사용 하 여, 전자 담배 액체의 적절 한 볼륨 탱크에서 로드 되 다는 것을 확인 하 고 나사 510 스레드 기지에 탱크.
4. 흡입 포트 (그림 1, #1) 기존의 또는 전자 담배 끝을 삽입 하 고 호스 클램프와 보안.
5. 진공 펌프를 켭니다.
6. 1.65 L/분 2 초 동안 55 mL 퍼프 수 있도록 뽑아 유량을 조정 합니다.
7. 마이크로컨트롤러를 켭니다. 일반 담배를 사용 하는 경우 첫 번째 퍼프에 담배 불.
8. 예상 될 때까지 실행 원하는 농도 (% 또는 백만 당 부분에 중량/볼륨) 이루어집니다.
9. 분석 균형을 사용 하 여 증발 후 각 전자 담배 cartomizer/탱크의 질량을 결정 합니다. 대량 소비 하는 총을 확인 하려면 단계 3.1에서에서 찍은 측정에이 측정을 비교 합니다. 용 매 소모 질량/볼륨의 농도 계산 합니다. 소비 니코틴의 어 금 니 농도 사용 하 여 제품 사이 정상화.
   1. 부족 한 질량, 소비 하는 경우 장치에 전자 담배를 반환 하 고 더 사용 합니다.
   2. 충분 한 또는 초과 대량 소비, 진행 합니다.

4. 여과 및 저장

1. 추출 물 세포 배양에 사용할 경우 0.22 μ m PES 주사기 필터를 통해 필터링.
2. 추출을 즉시 사용 하거나-80 ° C에 저장 합니다. 앤더슨, 그 외 에 대 한 준비의 일환으로 ⁸, 전자 담배 졸 적어도 2 주 동안 안정적인 것으로 입증 되었다 고 담배까지 2 년 동안 연기의 안정성 도둑 놈, 그 외 여러분 에 의해 설립 되었습니다. ¹³.

5. 청소 장치

1. 각 추출 후 튜브를 헹 구 고 샘플 사이 월 저수지의 70% 에탄올 및 방지 하기 위해 이온된 수 장치.
2. Rinsing, 간단히 지원 라인의 건조 공기 수 있도록 빈 장치를 실행 하는 다음.

6. 샘플 응용 프로그램 1: 중립 빨간 글귀 세포 생존 능력 분석 실험

1. 위의 내 피 세포 성장 매체의 4.3 mL로 추출을 수행 합니다.
2. 1 일 이전, 1 x 10⁴ 셀/웰 린 내 피 세포 성장 매체의 100 µ L의 밀도에서 96 잘 접시로 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포를 씨.
3. 셀 컨트롤 역할을 신선한 내 피 세포 배양 매체의 어느 100 µ L 또는 내 피 성장 세포 성장 매체 소비 2mm 니코틴 농도 추출 (1.4 mg의 25 µ L 혼합의 75 µ L 오래 된 내 피 세포 배양 매체를 대체 하 여 치료 4.3 mL 내 피 세포 성장 매체에 니코틴 소비) 치료로 500 µ M의 최종 농도 대 한.
4. 두 담배 연기 및 전자 담배에 어로 졸의 구성 요소 중 많은 휘발성, 호 일 씰을 사용 하 여 우물을 밀폐 유지.
5. 플레이트 18-24 h를 품 어 37 ° C, 5% CO₂.
6. 중립 빨강 얼룩이 솔루션을 준비:
   1. 버퍼링 된 소금 솔루션의 10 mL에 중립 붉은 염료의 33 mg를 용 해 하 여 100 x 중립 빨간색 재고 솔루션을 만듭니다.
   2. 사용 직전 솔루션 얼룩 중립 빨강 x 1을 만드는 세포 배양 매체에서 재고 솔루션 1: 100 x 100을 희석.
   3. 즉시 사용 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 솔루션 얼룩 중립 레드를 품 어.
      참고: 외피 동안 침전을 몇 가지 결정을 위해 정상적 이다. 이러한 결정 셀 문화 웰 스에 적용 하지 않도록 주의 해야 합니다. 필요한 경우, 중립 빨간색 재고 및 얼룩 솔루션 필터링 하 22 구경 µ m 필터를 사용할 수 있습니다.
7. 추출 제거 하 고 중립 빨강 적절 한 정량화를 위한 적어도 3 개의 빈 우물을 만드는 데 사용 초과 음, 당 솔루션 얼룩의 100 µ L를 추가 합니다.
8. 2-4 h 37 ° C, 5% CO₂접시를 품 어.
9. 중립 빨강 솔루션 얼룩을 제거 하 고 PBS에 침수에 의해 3 배를 씻어.
10. 중립 빨강 적용 취소 (50% 이온된 물, 49% 에탄올, 1% 아세트산) 솔루션 얼룩.
11. 떨고와 실내 온도에 적어도 10 분을 품 어.
12. 540에서 흡 광도 읽고 nm.
13. 빈 우물의 평균 값을 빼서 고 잘 빈 조정된 컨트롤 값의 평균을 표준화 하 여 데이터를 분석.

7. 샘플 응용 프로그램 2: 가스 착 색 인쇄기 질량 분석

1. 추출으로 위의 5 mL로 아세톤의 수행 합니다.
2. 실행 당 ~ 100 부품의 최종 농도 달성 하기 위해 장치 백만 (e 액체 소비/양의 아세톤의 무게) 샘플의.
3. 정밀 유리 주사기를 사용 하 여, GC-MS 장치 인젝터에 1 µ L을 주입 수 있습니다. 250 ° C에서 1:20 비율 다음 오븐 프로토콜 ZB-5 열을 갖춘 결합 된 가스 크로마 토 그래프/4 극 자 분석기에 분할 주입: 50 ° C에서 1 분 140 ° C에 10 ° C/min 진입로 300 ° C에 20 ° C/min를 진입 하 고 10 분 동안.
4. 대상 라이브러리에 어로 졸 구성 요소 식별에 결과 질량 스펙트럼을 일치 합니다.

결과

인간의 탯 줄 정 맥의 노출의 24 시간 이내에 기존 담배 연기 추출 (CSE) 또는 전자 담배 졸 내 피 세포 추출 (EAE), 거기에 중요 한 (CSE P 대 제어 < 0.001; EAE P 대 제어 < 0.01; n = 6) 세포 생존 능력 (그림 3A)에 감소. 추출 물 2, 2 초, 분당 55 mL 퍼프 puffing 프로필 생성 했다 고 정규화에 따라 어 금 니 농도 장치에서 사용 하는 니코틴의. CSE의 500 µ M ?...

토론

이 프로토콜의 가장 중요 한 요소는 보장 장치는 깨끗 한 시작 되며 각 추출의 완료 그리고 모든 물개는 그렇게 유지 되도록 공기 흐름을 일관 된 남아 있습니다. 장치가 제대로 청소 되지 않는 경우 수행의 위험에 사이 있다 샘플. 또한, 장치 시간 압축된에 어로 졸의 오랜된 기간에 대 한 부정한 왼쪽 고 건조 용 매 시스템을 차단할 수 있습니다. 참고 거기 피 기존의 담배와 공기 압력 강하를 수 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 V AC/DC Wall Mount Adaptor	Digi-Key	T1099-P5P-ND
2.2 Ohm Resistors	Digi-Key	A105635-ND	Used in tandem to generate the 4.4 Ohm resistance in Figure 2A
330 Ohm Resistors	Digi-Key	330QBK-ND
510 Threaded Base	NJoy	N/A	Recovered by dismantalling a second generation NJoy electronic cigarette
Acetic Acid, Glacial	Sigma-Aldritch	A6283
Acetone (Chromatography Grade)	Sigma-Aldritch	34850
Basic Stamp Project Board	Digi-Key	27112-ND	This board contains the BS1 Microcontroller, serial adaptor, power switch, and a barrel pin connector for the AC/DC Wall Mount Adaptor
Basic Stamp USB to Serial Adapter	Digi-Key	28030-ND	An optional component to allow the BS1 serial adaptor to communicate through USB
Buchner Flask (Vacuum Flask) 250 mL	VWR	10545-854
Clear Tape	3M	S-9783
Clear Vinyl Tubing, 3/8" ID	Watts	443064
EGM-2 Endothelial Cell Culture Medium	Lonza	CC-3162
Ethanol	Pharmco-Aaper	111000200
Flow Regulator	Dwyer	VFA-23-BV
Gas Chromatograph	Varian	450-GC
Glass Syringe, 10 mL	Sigma-Aldritch	Z314552
Glass Syringe, 10 µL	Hamilton	80300
High Vacuum Silicon Grease	Dow Corning	146355D
Hose Clamp	Precision Brand	35125
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	ATCC	PCS-100-013
Mass Spectrometer	Varian	300-MS
Midget Impinger	Chemglass	CG-1820-01
Neutral Red	Sigma-Aldritch	N4638
Paraffin Film	3M	PM-992
Plate Seal Roller	BioRad	MSR0001
Plate Seal; Foil	Thermo	276014
Ring Stand 20"	American Educational Products	7-G15-A
Solenoid Valve (normally open)	US Solid	USS2-00081
Solid State Relay	Digi-Key	CLA279-ND
Stand Clamp	Eisco	CH0688
Syringe Filter, PES, 0.22 um	Millipore	SLGP033RS
Syringe, 10 mL	BD Syringe	309604
Through Hole Stopper, Size 6	VWR	59581-287
Vacuum Pump	KNF Neuberger	N86KTP