JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлены два метода для определения функции, кишечный барьер. Эпителиальный метр (ом/вольт) используется для измерения электрического сопротивления transepithelial культивировали эпителия непосредственно в скважинах культуры ткани. В мышей FITC-декстран затравки метод используется для определения кишечную проницаемость в естественных условиях.

Аннотация

Кишечный барьер защищает от патогенных микроорганизмов и микробного токсина. Его функция регулируется жесткой перехода проницаемость и целостности эпителиальных клеток, и нарушение функции кишечника барьер способствует прогрессирование заболевания желудочно-кишечного тракта и системные. Два простых способа описаны здесь для измерения проницаемость кишечного эпителия. В пробирке, Како 2BBe клетки покрыты в культуре ткани скважин как монослоя и transepithelial электрического сопротивления (тер) может быть измерена по счётчикам эпителиальных (ом/вольт). Этот метод является убедительным из-за его удобного операции и повторяемость. В естественных условиях, мышей gavaged с 4 кДа флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстран и концентрации FITC-декстран измеряются в пробах сыворотки, собранных мышей для определения эпителиальной проницаемости. Пероральная затравка обеспечивает точную дозу и поэтому является предпочтительным методом для измерения проницаемости кишечника в естественных условиях. Взятые вместе, эти два метода могут измерять проницаемость кишечного эпителия в пробирке и в естественных условияхи таким образом быть использованы для изучения связи между заболеваниями и барьерную функцию.

Введение

Кишечные эпителиальные клетки отвечают не только за поглощение питательных веществ, но также образуют важный барьер для защиты от патогенных микроорганизмов и токсинов, микроорганизмов. Эта функция кишечный барьер регулируется жесткой перехода проницаемость и эпителиальных клеток целостности1,2,3, и дисфункции эпителиальных барьерной функции ассоциируется с воспалительных кишечника болезнь (IBD). Кольцо actomyosin perijunctional (PAMR) лежит в пределах ячейки, тесно примыкать плотные соединения. Сокращение PAMR, который регулируется лёгкие цепи миозина (док), имеет решающее значение для регулирования туго Джанкшен проницаемость4,5,6,,78, 9,10. Фактор некроза опухоли (ФНО) является центральным элементом кишечный барьер потери по upregulating кишечного эпителия док киназы (MLCK) выражение и вызывая occludin интернализации11,,12-13.

Ионы Na+ и Cl– могут пересекать пространство параклеточный поры или утечки путь14. В «Дырявый» эпителия изменения в Тер главным образом отражают изменены туго Джанкшен проницаемости. Измерение тер представляет собой часто используемые электрофизиологических подход к количественно туго Джанкшен проницаемость, главным образом в+ Na и Cl-, основанный на сопротивление клетки монослои. Типов различных клеток, включая клетки кишечного эпителия, легочной эпителиальных клеток и сосудов эндотелиальных клеток, были зарегистрированы для измерения тер. Преимущества этого метода, что Тер измерения неинвазивные и может быть использован для мониторинга живой клетки в режиме реального времени. Кроме того метод измерения Тер полезен для исследования токсичности препарата15.

Како 2BBe клетки являются клетки человека эпителия кишки аденокарциномы с структурой и функцией похож на дифференцированной малого кишечника эпителиальных клеток: к примеру, эти клетки имеют микроворсинки и ферментов, связанных с щеточкой кишечника границы. Таким образом искусственный монослои Како 2BBe используются как модель в пробирке для тестирования барьерную функцию.

В мышей один из способов изучить проницаемость кишечного параклеточный является путем измерения способности FITC-декстран крест из просвета в кровь. Таким образом Кишечная проницаемость может оцениваться gavaging FITC-декстран непосредственно в мышей и измерения флуоресценции в крови. Следующий протокол описывает два простых методов для оценки проницаемость кишечного эпителия в пробирке и в естественных условиях.

протокол

Это исследование было одобрено животное уход и использование протокола из Кембриджа-Suda геномной ресурсный центр (CAM-Су), Soochow университета.

1. обшивка и поддержание Како 2bbe на пористых поликарбоната мембраны

  1. Рост клеток в колбе T75 с СМИ (DMEM, содержащие 10% FBS). Фляги должны подаваться регулярно, в зависимости от плотности клеток.
    Примечание: Для оптимального покрытия, клетки следует разделить быстро и имеют форму плоской «жареный яйцо», который указывает, что клетки находятся в фазе роста.
  2. После того, как клетки 80% вырожденная, принимать настой из инкубатора и удалить средства массовой информации. Промойте любых остаточных средств массовой информации с 1-2 мл стерильного PBS (без Ca2 +). Накапайте 1,5 мл трипсина-ЭДТА в колбу и мягко рок колбу; затем место колбу в инкубаторе 37 ° C 20 мин без качания.
  3. В то время как клетки trypsinizing, место вставляет, содержащие пористых поликарбоната мембраны (Размер поры, 0,4 мкм; площадь поверхности, 0,33 см2; см. Таблицу материалы) в 24-ну пластины. Добавление 1,0 мл культуры средств массовой информации в зале базальную (нижнюю площадь мембраны).
  4. Накапайте 5 мл СМИ в колбу и энергично накапайте клетки против стороны колбы 5 - 10 раз для достижения сыпучих, отдельные ячейки или ячейки 2-3 сгустки.
  5. Пластина 0,166 мл клеток (достижение коэффициент разбавления 1:8) в апикальной камеру (верхняя пространства мембраны). Инкубируйте при 37 ° C до 3 недель.
    1. Кормить клетки три раза каждую неделю, тщательно аспирационных СМИ от базальной отсек каждый хорошо с помощью давления насоса. Аккуратно капельно 1 мл СМИ в апикальной палаты каждой вставки.

2. Использование эпителиальных метр (ом/вольт) для измерения Тер

Примечание: После 3 недель культуры на поликарбонат мембраны, клетки Caco-2BBe готовы к Тер измерения.

  1. Для исследования cytokine один день перед измерением, замените СМИ, содержащие 10 нг/мл IFNγ базальной СМИ. В день эксперимента замените HBSS, содержащие 2,5 или 7,5 нг/мл ФНО СМИ.
    Примечание: IFNγ лечения увеличивает выражение ФНО рецептор 2 (TNFR2)16.
  2. Чтобы исправить метр, вставьте коррекции электрод в порт ввода и выбрать режим «Ом». Отрегулируйте R Adj винт с помощью отвертки до тех пор, пока индикатор показывает чтения 1000 Ω.
  3. Стерилизовать электродов, помещая их в 70% этанола для 15-30 мин, а затем дать им высохнуть за 15 с. промойте электрод в экспериментальной клетки культуры средств массовой информации.
  4. Включите питание и выбрать режим «Ом». Осторожно поместите длинные концы электродов мостов в базальной камеру и короткие концы в апикальной камеру. Обеспечить больше электродов касаться дна блюдо, сохраняя короче электроды ниже поверхности средств массовой информации, но выше вставки культуры ткани. Держите вертикальных электродов.
  5. Измерьте сопротивление образца вставок и пустые вставки (т.е., что культура вкладыши без клетки, но с HBSS) на 0, 1, 2, 3, 4 h после лечения цитокина. Записи стойкость.
  6. Для достижения согласованности различных форматов различных пластины, вычислите произведение сопротивления и области эффективного мембраны:
    figure-protocol-3393
    Для 24-ну вставки эффективную мембрану площадь составляет 0,33 см2.

3. мышиных модель декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированной колит

  1. Добавьте DSS газобетона воды до конечной концентрации 3,5% (wt/vol).
  2. Администрировать 3,5% DSS для 8-недельных самцов мышей C57BL/6 для в общей сложности 7 дней. Дать очередной питьевой воды без DSS управления мышей.
    1. Переключатель DSS-содержащих воду регулярно питьевой воды после 7 день.
  3. Взвешивание мышей и оценки клинической оценки каждой мыши каждый день. Нормализации веса тела каждой мыши, чтобы его первоначального веса. Баллы по тяжести заболевания определяются четырьмя параметрами: выпадение прямой кишки (0-2), стул последовательности (0-2), кровотечения (0-2) и деятельности (0-2)5. Сумма баллов из этих параметров для окончательного клиническая оценка.
  4. Чтобы проанализировать состояние гистопатологические толстой ткани, усыпить мышей впрыской внутрибрюшинного (и.п.) с 1,2% (vol/vol) Avertin (0,6 мл/10 г веса тела) 7 дней пост DSS лечения. Подготовить запас 100% Авертен, Смешайте 10 г 2,2,2-tribromoethanol с 10 мл трет Амиловый спирт.  Хранить в темноте при 4° C. Чтобы использовать, разбавляют 100% акций до 2% в воде.
  5. Изолировать слепой кишки и толстой кишки и измерить длину двоеточия5.
  6. Вырежьте сегменты 0,5 см от дистальной части толстой кишки и исправить в 15 мл Сокол тубы 10 мл формалина 10% на ночь. Мыть фиксированных тканей с градуированной этанола (75, 95 и 100%) и ксилола. Внедрить в парафин ткани и сократить разделы 6 мм для гематоксилином и эозином, окрашивание8.

4. Измерение проницаемость эпителия барьер DSS-индуцированной колит мышей

  1. Измерения проницаемости барьер 7 дней после начала DSS администрации.
  2. В день assay быстро мышей за 3 ч.
  3. Автоклав затравки иглы для обеспечения стерильности, затем затравки мышей с 150 мкл kDa 80 мг/мл 4 FITC-декстрана в стерильной воде и держать неиспользуемые FITC-декстран измерить калибровочной кривой после сбора сыворотки. Взвешивание мышей для расчета проницаемости.
    Примечание: В воде следует решение FITC-декстрана.
  4. С помощью ножниц, клип 1 см кусок хвост и собирать 100 мкл крови от хвоста в сыворотке крови коллекции трубок. Спиновые собранной крови на 10000 x g 10 мин при комнатной температуре.
  5. Разбавьте сыворотки 1:4 в воде. Чтобы сделать стандарт кривой, разбавить неиспользуемые FITC-декстрана с водой 1: 300, 1:1, 000, 1:3, 000, 1:10, 000, 1:30, 000, 1: 100 000, 1: 300, 000, 1:1, 000, 000 и 1:3, 000, 000. Добавьте 100 мкл/колодец сыворотки и образцы калибровочной кривой в 96-луночных пластины.
  6. Читайте флуоресценции в тарелку читателя с 485 возбуждения/528 выбросов. Рассчитать значения проницаемости, основанные на стандартной кривой и умножить на 4 исправить для разбавления.
  7. Разделите концентрацию FITC-декстран вес нормализовать значения (это помогает нормализовать разницу в FITC-декстран доставки, если мышами больны и потеряли вес).

Результаты

В культуре Како 2BBe клетки растут как монослоя и медленно дифференцироваться в зрелых освоения enterocytes, имеющих кисть границы. В этом протоколе Како 2BBe клетки были покрытие с высокой плотностью на поликарбонат мембраны, и клетки достигли 100% confluency один день после посева. ?...

Обсуждение

Есть несколько важных шагов в протоколе. Како 2BBe (кисть границы выражая) клетки всегда используются для измерения тер, от линии клеток Caco-2 для выражения кисти границы белков. Како 2BBe клетки имеют ворсинок освоения фенотип когда полностью дифференцированной (примерно через 3 недели посл?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-р Тернер Джерролд р., от Бригама и женской больнице, Гарвардской медицинской школы, за его щедрую помощь в завершении этого исследования. Эта работа поддерживается Национальный фонд естественных наук Китая (номер гранта, 81470804, 31401229 и 81200620), естественные науки фонд провинции Цзянсу (номер гранта BK20180838 и BK20140319), программа исследований инноваций для Выпускники колледжа провинции Цзянсу (номер KYLX16-0116 Грант), передовых исследовательских проектов Soochow университета (Грант № SDY2015_06) и крона и колит Стипендия фонда научных исследований (Грант номер 310801).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
22 G gavage needleVWR20068-608
4 kDa FITC-dextranSigma46944
AvertinSigmaT48402
Black 96-well plates for fluorescenceFisher14-245-197A
C57/B6 miceNanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Caco-2BBe cellsATCCCRL-2102
Dextran sulphate sodiumMP Biomedicals2160110
DMED with high glucose and sodium pyruvateHycloneSH30243.01B
Epithelial (Volt/Ohm) MeterMillicell-ERSMERS00002
EthanolSinopharm ChemicalReagent10009218
Falcon tube (15 mL)Corning430791
FBSGibco10437-028
Fluorescence microscopeOlympusFV1000
FluorometerBiotekSynergy 2
HBSS138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose 
IFNgPeproTech315-05-20
Modular Tissue Embedding CenterLeicaEG1150H
Serum collection tubesSarstedt41.1378.005
T75 flaskcorning430641
TNFPeproTech315-01A
ParraffinSigmaA6330-1CS
Polycarbonate membranes (Transwell)Costar3413
Pressure pumpAUTOSCIENCEAP-9925
Rotary MicrotomyLeicaRM2235
Trypsin-EDTAGibco25200-056
XyleneSinopharm ChemicalReagent10023418

Ссылки

  1. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
  2. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
  3. Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
  4. Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
  5. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
  6. Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
  7. Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
  8. He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
  9. He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
  10. Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
  11. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
  12. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
  13. Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
  14. Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
  17. Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
  18. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140transepithelialFITC2BBe

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены