In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

Riepilogo

Qui sono disponibili due metodi per determinare la funzione di barriera intestinale. Un contatore epiteliale (volt/ohm) è utilizzato per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale del epithelia coltivate direttamente in pozzi di coltura del tessuto. Nei topi, il metodo di alimentazione mediante sonda gastrica FITC-Destrano è utilizzato per determinare la permeabilità intestinale in vivo.

Abstract

La barriera intestinale difende contro i microrganismi patogeni e tossine microbiche. La sua funzione è regolata dalla stretta della giunzione permeabilità e l'integrità delle cellule epiteliali, e rottura della funzione di barriera intestinale contribuisce alla progressione di malattia gastrointestinale e sistematica. Due semplici metodi descritti qui per misurare la permeabilità dell'epitelio intestinale. In vitro, le cellule Caco-2BBe sono placcate in pozzi di coltura del tessuto come uno strato monomolecolare e resistenza elettrica transepiteliale (TER) può essere misurato con un misuratore di epiteliale (volt/ohm). Questo metodo è convincente per la sua facilità di utilizzo e ripetibilità. In vivo, i topi sono gavaged con 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano e le concentrazioni di FITC-Destrano sono misurati in campioni di siero raccolti da topi per determinare la permeabilità epiteliale. Alimentazione mediante sonda gastrica orale offre una dose precisa e pertanto è il metodo preferito per misurare la permeabilità intestinale in vivo. Presi insieme, questi due metodi in grado di misurare la permeabilità dell'epitelio intestinale in vitro e in vivoe quindi essere usati per studiare la connessione tra malattie e funzione di barriera.

Introduzione

Cellule epiteliali intestinali non sono solo responsabili per l'assorbimento dei nutrienti, ma anche formano una barriera importante per difendere contro microrganismi patogeni e tossine microbiche. Questa funzione di barriera intestinale è regolata da permeabilità stretta della giunzione e delle cellule epiteliali integrità^1,2,3, e disfunzione della funzione di barriera epiteliale è associata con infiammatorie intestinali malattia (IBD). L'anello di actomiosina perijunctional (PAMR) si trova all'interno della cellula che è strettamente contigua per giunzioni strette. La contrazione di PAMR, che è regolata dalla catena leggera della miosina (MLC), è cruciale per la regolazione della stretta della giunzione permeabilità^{4,5,6,7,8, 9,10}. Fattore di necrosi tumorale (TNF) è centrale alla perdita della barriera intestinale espressione di chinasi (MLCK) upregulating epiteliale intestinale MLC e inducendo occludina interiorizzazione^11,12,13.

Ioni come Na⁺ e Cl^– può attraversare lo spazio paracellulare di poro o perdita via¹⁴. In un epitelio "colante", cambiamenti in TER riflettono principalmente permeabilità alterata stretta della giunzione. Misurazione di TER è un approccio elettrofisiologico comunemente utilizzato per quantificare la permeabilità stretta della giunzione, principalmente a Na⁺ e Cl^-, basato sull'impedenza di monostrati di cellule umane. Tipi di cellule diverse, tra cui le cellule epiteliali intestinali, cellule epiteliali polmonari e le cellule endoteliali vascolari, sono stati segnalati per misurazioni di TER. Vantaggi di questo metodo sono che le misurazioni TER sono non-invasivo e possono essere utilizzate per monitorare le cellule vive in tempo reale. Inoltre, la tecnica di misurazione TER è utile per droga tossicità studi¹⁵.

Caco-2BBe cellule sono cellule epiteliali umane dell'adenocarcinoma del colon-retto con una struttura e funzione simili a piccole cellule epiteliali intestinali differenziate: ad esempio, queste cellule hanno microvilli ed enzimi connessi con la piccola spazzola intestinale confine. Di conseguenza, coltivate Caco-2BBe monostrati sono utilizzati come un modello in vitro per verificare la funzione della barriera.

Nei topi, un modo per studiare la permeabilità intestinale paracellulare è misurando la capacità di FITC-dextrano di attraversare dal lume nel sangue. Così, la permeabilità intestinale può essere valutata da gavaging FITC-Destrano direttamente in topi e misurare la fluorescenza all'interno del sangue. Il seguente protocollo descrive due semplici metodi per valutare la permeabilità dell'epitelio intestinale sia in vitro che in vivo.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e uso protocollo di Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow University.

1. placcatura e la manutenzione di Caco-2bbe sulle membrane porose in policarbonato

1. Crescere le cellule in una boccetta di T75 con media (DMEM contenente 10% FBS). Boccette dovrebbero essere alimentati regolarmente, a seconda della densità delle cellule.
   Nota: Per la placcatura ottima, cellule dovrebbero dividersi rapidamente e hanno una forma piatta "fritto-uovo", che indica che le cellule sono in fase di crescita.
2. Una volta che le cellule sono 80% confluenti, prendere il pallone fuori l'incubatrice e rimuovere il supporto. Sciacquare ogni residua media con 1-2 mL di PBS sterile (senza Ca^{2 +}). Pipettare 1,5 mL di tripsina-EDTA nel pallone e delicatamente roccia il pallone; quindi, posizionare il pallone nell'incubatore 37 ° C per 20 min senza a dondolo.
3. Mentre le cellule sono trypsinizing, posto inserisce contenente membrane porose in policarbonato (diametro dei pori, 0,4 µm; superficie, 0,33 cm²; Vedi Tabella materiali) in piastre da 24 pozzetti. Aggiungere 1,0 mL di terreno di coltura in aula basale (lo spazio inferiore della membrana).
4. Pipettare 5 mL di media nella boccetta e vigorosamente dispensare le cellule contro il lato del pallone di 5 - 10 volte per raggiungere sciolte, singole celle o cella di 2-3 ciuffi.
5. Piastra di 0,166 mL di cellule (raggiungimento di un rapporto di diluizione di 1:8) nella camera di apicale (lo spazio superiore della membrana). Incubare a 37 ° C fino a 3 settimane.
   1. Alimentazione celle tre volte settimanalmente aspirando attentamente i media dal basale vano di ogni pozzetto usando una pompa a pressione. Delicatamente gocciolare 1ml di media nella camera apicale di ciascun frutto.

2. uso del Meter epiteliale (Volt/Ohm) per la misurazione TER

Nota: Dopo circa 3 settimane di cultura sulle membrane in policarbonato, cellule Caco-2BBe sono pronte per la misurazione di TER.

1. Per gli studi di citochina, un giorno prima della misura, sostituire il supporto basale con supporti contenenti 10 ng/mL di IFNγ. Il giorno dell'esperimento, è necessario sostituire il supporto con HBSS contenente 2,5 o 7,5 ng/mL di TNF.
   Nota: Trattamento IFNγ aumenta l'espressione del recettore TNF 2 (TNFR2)¹⁶.
2. Per correggere il misuratore, inserire l'elettrodo di correzione nella porta di ingresso e scegliere la modalità "Ohm". Regolare la vite R Adj con un cacciavite fino a quando il misuratore visualizza una lettura di 1.000 Ω.
3. Sterilizzare gli elettrodi ponendoli in etanolo al 70% per 15-30 min e poi lasciare li asciugare all'aria per 15 s. Risciacquare l'elettrodo nel mezzo di coltura cellulare sperimentale.
4. Accendere l'unità e scegliere la modalità di "Ohm". Posizionare l'estremità lunga dei ponti elettrodo nella camera basale ed il breve finisce nella camera di apicale. Assicurarsi che gli elettrodi più tocchino il fondo del piatto, mantenendo gli elettrodi più brevi sotto la superficie della media, ma soprattutto gli inserti di coltura del tessuto. Mantenere gli elettrodi verticali.
5. Misurare la resistenza del campione inserti e inserti in bianco (cioè, la cultura inserisce senza cellule ma con HBSS) a 0, 1, 2, 3, 4 h dopo il trattamento di citochina. Registrare la resistenza.
6. Per garantire la coerenza tra piastra diversi formati, è possibile calcolare il prodotto della resistenza e l'area della membrana efficace:
   
   Per inserti 24 pozzetti, l'area della membrana efficace è 0,33 cm².

3. modello murino di sodio del solfato del dextrano (DSS)-colite indotta

1. Aggiungere DSS in autoclave acqua ad una concentrazione finale pari al 3,5% (wt/vol).
2. Amministrare il 3,5% DSS ai topi C57BL/6 maschi di 8-settimana-vecchio per un totale di 7 giorni. Dare acqua potabile normale senza DSS ai topi di controllo.
   1. Passare il DSS-contenenti acqua per acqua potabile normale dopo 7 giorno.
3. Topi di pesare e valutare punteggi clinici di ogni mouse ogni giorno. Normalizzare il peso corporeo di ogni topo al suo peso corporeo iniziale. Punteggi sono definiti secondo la severità di malattia da quattro parametri: prolasso rettale (0-2), la consistenza delle feci (0-2), sanguinamento (0-2) e attività (0-2)⁵. Sommare i punteggi da questi parametri per un punteggio clinico finale.
4. Per analizzare la condizione istopatologica del tessuto del colon, eutanasia topi tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.) con trattamento di 1,2% (vol/vol) Avertin (peso corporeo di 0,6 mL/10 g) 7 giorni post-DSS. Per preparare un brodo di 100% avertin, mescolare 10 g di 2,2,2-tribromoethanol con 10 ml di alcool tert-Amilico.  Conservare al buio a 4° C. Per utilizzare, diluire cartoncino 100% al 2% in acqua.
5. Isolare il colon e intestino cieco e misurare la lunghezza dei due punti⁵.
6. Tagliare segmenti di 0,5 cm dal colon distale e correzione in un tubo falcon da 15 mL contenente 10 mL di formalina al 10% durante la notte. Lavare i tessuti fissi con etanolo graduato (75, 95 e 100%) e xilene. Incorporare i tessuti in paraffina e tagliare sezioni da 6 mm per l'ematossilina ed eosina⁸.

4. misurare la permeabilità della barriera epiteliale nei topi di colite DSS indotta

1. Misurare la permeabilità della barriera 7 giorni dopo l'inizio della somministrazione di DSS.
2. Il giorno del test, veloce topi per 3 h.
3. Autoclave una sonda gastrica dell'ago per garantire la sterilità, quindi i topi di sonda gastrica con 150 µ l 80 mg/mL 4 kDa FITC-Destrano in acqua sterile e mantenere il FITC-Destrano inutilizzato per misurare la curva standard dopo la raccolta del siero. Pesare i topi per il calcolo di permeabilità.
   Nota: La soluzione di FITC-Destrano dovrebbe essere fatto in acqua.
4. Utilizzando un paio di forbici, un pezzo di 1 cm della coda di clip e raccogliere 100 µ l di sangue dalla coda nelle provette di raccolta del siero. Girare il sangue prelevato a 10.000 x g per 10 min a temperatura ambiente.
5. Diluire il siero 1:4 in acqua. Per rendere standard curva, diluire inutilizzato FITC-Destrano con acqua a 1: 300, 1:1, 000, 1:3, 000, 01:10, 000, 01:30, 000, 1: 100, 000, 1: 300, 000, 1:1, 000, 000 e 1:3, 000, 000. Aggiungere 100 µ l/pozzetto del siero e dei campioni di curva standard in piastre da 96 pozzetti.
6. Leggere la fluorescenza in un lettore di piastra con 485 eccitazione/528 emissione. Calcolare i valori di permeabilità basati sulla curva standard e moltiplicare per 4 per correggere per la diluizione.
7. Dividere la concentrazione di FITC-Destrano per il peso per normalizzare i valori (questo aiuta a normalizzare la differenza nella consegna di FITC-Destrano se topi sono malati e hanno perso peso).

Risultati

In coltura, cellule Caco-2BBe crescono come uno strato monomolecolare e lentamente differenziano in enterociti assorbenti maturi che hanno bordi del pennello. In questo protocollo, le cellule Caco-2BBe sono state placcate con un'alta densità su membrane in policarbonato e celle raggiunto 100% confluency un giorno dopo la semina. Tuttavia, le cellule sono indifferenziate in questa fase: completamente differenziare le cellule, il media è cambiato ogni 2-3 giorni per 3 settimane. Le cellul...

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Le cellule Caco-2BBe (confine-esprimendo la spazzola) vengono sempre utilizzate per la misurazione di TER, selezionato dalla linea delle cellule Caco-2 per l'espressione delle proteine del spazzola-confine. Le cellule Caco-2BBe hanno un fenotipo assorbente del villo quando completamente differenziato (dopo circa 3 settimane di post-confluenza cultura)¹⁷. È necessario per evitare la contaminazione durante la misurazione e per sterilizzare l'elettrod...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G gavage needle	VWR	20068-608
4 kDa FITC-dextran	Sigma	46944
Avertin	Sigma	T48402
Black 96-well plates for fluorescence	Fisher	14-245-197A
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Caco-2BBe cells	ATCC	CRL-2102
Dextran sulphate sodium	MP Biomedicals	2160110
DMED with high glucose and sodium pyruvate	Hyclone	SH30243.01B
Epithelial (Volt/Ohm) Meter	Millicell-ERS	MERS00002
Ethanol	Sinopharm ChemicalReagent	10009218
Falcon tube (15 mL)	Corning	430791
FBS	Gibco	10437-028
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
Fluorometer	Biotek	Synergy 2
HBSS			138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose
IFNg	PeproTech	315-05-20
Modular Tissue Embedding Center	Leica	EG1150H
Serum collection tubes	Sarstedt	41.1378.005
T75 flask	corning	430641
TNF	PeproTech	315-01A
Parraffin	Sigma	A6330-1CS
Polycarbonate membranes (Transwell)	Costar	3413
Pressure pump	AUTOSCIENCE	AP-9925
Rotary Microtomy	Leica	RM2235
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Xylene	Sinopharm ChemicalReagent	10023418