생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

요약

두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.

초록

장 방 벽은 병원 성 미생물 및 미생물 독 소에 대 한 방어. 그것의 기능은 꽉 접합 침투성 및 상피 세포 무결성에 의해 규제 됩니다 그리고 위장과 전신 질환의 진행에 기여 하는 장의 장벽 기능 장애. 두 가지 간단한 방법 장 상피의 투과율을 측정 하 여기 설명 되어 있습니다. 생체 외에서Caco 2BBe 세포는 조직 문화 우물에는 단층으로 도금 및 transepithelial 전기 저항 (TER)는 상피 (볼트/옴) 미터에 의해 측정 될 수 있다. 이 메서드는 사용자 친화적인 작동과 반복성 때문에 설득력이 있다. Vivo에서, 마우스는 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)와 gavaged-dextran, 그리고 FITC dextran 농도 상피 침투성을 결정 하는 마우스에서 수집 된 혈 청 샘플으로 측정 된다. 구강 정확한 복용량을 제공 하 고 따라서 vivo에서창 자 침투성 측정을 선호 하는 방법 이다. 함께 찍은, 이러한 두 가지 방법을 장 상피 체 외 그리고 vivo에서의 침투성을 측정할 수 있다 하 고 따라서 질병 및 장벽 기능 사이의 연결을 공부 하는 데 사용 될.

서문

장 상피 세포는 영양분의 흡수에 대 한 책임 뿐만 아니라 그러나 또한 병원 성 미생물 및 미생물 독 소에 대 한 중요 한 방 벽을 형성. 이 장의 장벽 기능은 꽉 접합 침투성 및 상피 세포 무결성^1,2,3, 통제 되 고 상피 장벽 기능 부전은 염증 성 창 자 연관 질병 (IBD)입니다. Perijunctional actomyosin 반지 (PAMR)는 단단한 접속점에 밀접 하 게 인접 셀 이내에 거짓말. Myosin 빛 사슬 (MLC)에 의해 규제 됩니다, PAMR의 수축은 꽉 접합 침투성^{4,5,6,7,8, 규제에 대 한 중요 한 9,10}. 종양 괴 사 인자 (TNF) upregulating 장 상피 MLC 니 (MLCK) 식과 유도 occludin 국제화^11,,1213에 의해 장 방 벽 손실에 중앙 이다.

이온⁺ Na와 Cl^- 기 공 또는 누출 통로¹⁴paracellular 공간을 교차 수 있습니다. "새" 상피에서 TER에 변화는 주로 변경된 꽉 접합 침투성을 반영합니다. TER 측정 꽉 접합 침투성,⁺ Na와 Cl^-, 하 셀 monolayers의 임피던스에 따라 계량 하는 일반적으로 사용 되 electrophysiological 접근 이다. 장 상피 세포, 혈관 내 피 세포, 폐 상피 세포 등 다양 한 세포 유형 테 측정을 위해 보고 되었다. 이 방법의 이점은 TER 측정 비 침략 적 이며 실시간 라이브 셀 모니터링에 사용할 수 있습니다. 또한, 테 측정 기술은 약물 독성 연구¹⁵에 대 한 유용합니다.

Caco-2BBe 세포는 인간 상피 대 장 선 암 세포 구조와 차별화 된 작은 창 자 상피 세포와 유사한 기능: 예를 들어 이러한 세포는 microvilli 및 작은 창 자 브러시와 관련 된 효소 테두리입니다. 따라서, 교양된 Caco-2BBe monolayers 장벽 기능을 테스트 하기 위한 생체 외에서 모델 활용 됩니다.

쥐, 한 장 paracellular 침투성 공부 방법은 혈액으로 루멘에서 교차 FITC dextran 수를 측정 하 여. 따라서, 창 자 침투성 gavaging FITC dextran 직접 마우스와 혈액 내에서 형광을 측정에 의해 평가 될 수 있다. 다음 프로토콜 설명 장 상피 침투성을 평가 하기 위해 두 가지 간단한 방법 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보.

프로토콜

이 연구는 동물 관리 및 사용 프로토콜의 캠브리지 스 게놈 자원 센터 (캠-수), Soochow 대학에 의해 승인 되었다.

1. 도금 및 Caco-2bbe에 다공성 폴 리 카보 네이트 막의 유지 보수

1. 미디어 T75 플라스 크에 세포를 성장 (10% 포함 된 DMEM FBS). 플라스 크는 셀 밀도 따라 정기적으로 먹여야 한다.
   참고: 최적의 도금, 셀 해야 빠르게 분할 및 세포 성장 단계에가 평면 "튀김-계란" 모양.
2. 일단 세포가 80% 합칠, 인큐베이터에서 플라스 크를 걸릴 하 고 미디어를 제거 합니다. 1-2 mL (없이 캘리포니아^{2 +}) 살 균 PBS의 모든 잔여 미디어 린스. 피펫으로 1.5 mL 트립 신-EDTA 플라스 크와 부드럽게 바위 플라스 크; 그런 다음, 락 없이 20 분 동안 37 ° C 배양 기에서 플라스 크를 놓습니다.
3. 셀 trypsinizing는 하는 동안 장소 다공성 폴 리 카보 네이트 막 (0.4 µ m 기 공 크기, 표면적, 0.33 c m²; 재료의 표참조)를 포함 하는 24-잘 접시에 삽입 합니다. 기저 챔버 (막의 낮은 공간)에서 문화 미디어 1.0 mL를 추가 합니다.
4. 피펫으로 플라스 크와 적극적으로 피펫으로 미디어의 5 mL 플라스 크의 측에 대하여 세포 5-10 회, 개별 셀 또는 2-3 셀을 묶습니다.
5. 꼭대기 챔버 (막의 위 공간)로 셀 (1:8 희석 비율 달성) 0.166 mL 접시. 최대 3 주 동안 37 ° C에서 품 어.
   1. 피드 셀 세 번 매주 신중 하 게 잘 사용 하 여 각 압력 펌프의 기초 구획에서 미디어를 발음으로. 부드럽게 각 삽입의 꼭대기 챔버로 미디어의 1 mL를 똑.

2. 측정 TER 상피 미터 (볼트/옴)의 사용

참고: 약 3 주 후에 폴 리카 보 네이트 막 문화, Caco 2BBe 셀 테 측정을 위해 준비 되어 있다.

1. Cytokine 연구, 측정 전에 1 일 IFNγ의 10 ng/mL를 포함 하는 미디어와 기저 미디어를 교체 합니다. 실험 당일, HBSS 2.5 또는 7.5 ng/mL TNF의를 포함 하는 미디어를 바꿉니다.
   참고: IFNγ 치료 증가 표현의 TNF 수용 체 2 (TNFR2)¹⁶.
2. 미터를 해결 하기 위해 보정 전극 입력 포트에 삽입 하 고 "옴" 모드를 선택 합니다. 미터 1000 Ω의 읽기 표시 될 때까지 드라이버 R 조정 나사를 조정 합니다.
3. 15-30 분, 70% 에탄올에 그들을 배치 하 여 전극을 소독 하 고 있도록 공기 건조 15 미 린스 실험 세포 배양에 전극.
4. 켜고 전원, "옴" 모드를 선택 합니다. 신중 하 게 기저 실과 꼭대기 챔버로 짧은 끝에 전극 다리의 긴 끝을 놓습니다. 긴 전극 표면 조직 문화 삽입 낮지만 미디어의 아래 짧은 전극 유지 하면서, 접시의 바닥을 터치를 확인 합니다. 수직 전극 유지.
5. 0, 1, 2, 3, 4 h cytokine 치료 후에 샘플 삽입 및 빈 삽입 (즉, 문화 삽입 셀 없이 그러나 HBSS)의 저항을 측정 합니다. 저항을 기록 합니다.
6. 다른 판 형식에 걸쳐 일관성을 달성 하기 위해 저항과 유효 막 면적의 계산:
   
   24 잘 삽입에 대 한 효과적인 막 0.33 c m²입니다.

3. murine 모델 Dextran 황산 나트륨 (DSS)-대 장 염을 유발

1. 3.5% (wt/vol)의 최종 농도에 압력가 마로 소독 물에 DSS를 추가 합니다.
2. 3.5% 관리 7 일 총 8 주 오래 된 남성 C57BL/6 마우스 DSS. DSS 없이 일반 식 수 통제 쥐에 게.
   1. 스위치 7 일 후 일반 식 수에 DSS-포함 된 물.
3. 마우스 무게 및 매일 각 마우스의 임상 점수를 평가. 각 마우스의 초기 몸 무게를의 몸 무게를 정상화. 점수는 질병의 심각도 따라 4 개의 매개 변수에 정의 된: 직장 탈출 (0-2), 대변 일관성 (0-2), 출혈 (0-2), 및 활동 (0-2)⁵. 최종 임상 점수에 대 한 이러한 매개 변수에서 점수 합계.
4. 결 장 조직의 histopathological 상태 분석, 1.2% (vol/vol) Avertin (0.6 mL/10 g 체중) 7 일 게시물-DSS 치료와 복 (i.p.) 주입 하 여 마우스를 안락사. 100 %avertin의 주식, 혼합 준비 2,2,2 tribromoethanol의 10 g tert-산은 알코올의 10 ml로 한다.  4 ° c.에 어둠 속에서 저장 사용 하려면, 물에서 2%로 100% 주식 희석.
5. 결 장 및 맹, 분리 하 고 콜론⁵의 길이 측정.
6. 하룻밤 10% 포 르 말린의 10 mL를 포함 하 15 mL 송 골 매 관에 원심 결 장 및 수정에서 0.5 cm 세그먼트를 잘라. 세척 등급된 에탄올과 고정된 조직 (75, 95, 100%) 및 크 실 렌. 파라핀 조직을 포함 하 고 6mm 되며 & 오신⁸얼룩에 대 한 섹션을 잘라.

4. 측정 DSS 유도 Colitis 쥐에서 상피 장벽 침투성

1. 장벽 침투성 DSS 관리의 시작 후에 7 일을 측정 합니다.
2. 분석 결과 하루에 3 h에 대 한 마우스를 빨리.
3. 압력솥을 gavage 불 임, 150 µ L 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran 살 균 물에와 다음 gavage 쥐 되도록 바늘 하 고 혈 청 수집 후 측정 하는 표준 곡선을 사용 하지 않는 FITC dextran을 유지. 침투성 계산에 대 한 마우스의 무게.
   참고: FITC dextran 솔루션은 물에서 여야 한다.
4. 가 위를 사용 하 여 클립, 꼬리의 1 cm 조각 하 고 혈 청 컬렉션 튜브로 꼬리에서 혈액의 100 µ L를 수집 합니다. 실 온에서 10 분 동안 10000 x g에서 수집 된 혈액을 회전 합니다.
5. 희석 혈 청 1: 물에서 4. 표준 곡선, 사용 하지 않는 FITC-dextran 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000에서 물으로 희석을 1시 10분, 000, 1:30, 000, 1: 100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000과 1:3, 000, 000. 혈 청 및 표준 곡선 샘플 100 µ L/잘 96 잘 접시에 추가 합니다.
6. 485 여기/528 방출으로 플레이트 리더에서 형광을 읽기. 표준 곡선에 따라 침투성 값을 계산 하 고 희석에 대 한 해결에 4를 곱하십시오.
7. (이 마우스 아픈 하 고 체중을 잃 었 FITC dextran 배달에 차이 정상화를 통해) 값을 정규화 하 무게에 의해 FITC dextran의 농도 나눕니다.

결과

문화, Caco 2BBe 세포를 단층으로 성장 하 고 천천히 테두리 브러시를가지고 성숙한 흡수 성 enterocytes로 분화. 이 프로토콜에서 Caco 2BBe 셀 폴 리 카보 네이트 막에 높은 밀도와 도금 했다 하 고 셀에 도달 100 %confluency 시드 후에 1 일. 그러나 세포는 차별화 된이 단계에서: 완전히 셀 구분, 미디어 3 주 동안 2-3 일 마다 변경 됩니다. 세포 핵으로 물 했다 고 F 걸 미 분화 및 분화 세...

토론

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. Caco-2BBe (브러쉬 국경-표현) 셀 테 측정, 브러쉬-테두리 단백질의 표현 위한 Caco-2 셀 라인에서 선택한 항상 사용 됩니다. Caco-2BBe 세포는 모 흡수 형 때 (문화 후 합류의 약 3 주) 후 완전히 분화¹⁷. 측정, 동안 오염 방지 하 고 전극 소독이 필요 하다. 절차는 비 살 균, 측정은 최대 8 h 대부분의 경우에만 수행할 수 있습니다. 측정, 동안 우리 두...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G gavage needle	VWR	20068-608
4 kDa FITC-dextran	Sigma	46944
Avertin	Sigma	T48402
Black 96-well plates for fluorescence	Fisher	14-245-197A
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Caco-2BBe cells	ATCC	CRL-2102
Dextran sulphate sodium	MP Biomedicals	2160110
DMED with high glucose and sodium pyruvate	Hyclone	SH30243.01B
Epithelial (Volt/Ohm) Meter	Millicell-ERS	MERS00002
Ethanol	Sinopharm ChemicalReagent	10009218
Falcon tube (15 mL)	Corning	430791
FBS	Gibco	10437-028
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
Fluorometer	Biotek	Synergy 2
HBSS			138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose
IFNg	PeproTech	315-05-20
Modular Tissue Embedding Center	Leica	EG1150H
Serum collection tubes	Sarstedt	41.1378.005
T75 flask	corning	430641
TNF	PeproTech	315-01A
Parraffin	Sigma	A6330-1CS
Polycarbonate membranes (Transwell)	Costar	3413
Pressure pump	AUTOSCIENCE	AP-9925
Rotary Microtomy	Leica	RM2235
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Xylene	Sinopharm ChemicalReagent	10023418