Спонтанного формирования и перегруппировки искусственных липидов нанотрубок сетей как модель снизу вверх для эндоплазматического ретикулума

Резюме

Твердое поддерживается, белка бесплатно, фосфолипидный бислоя мембраны (DLBM) могут быть преобразованы в сложные и динамичные липидов нанотрубок сетей и может служить 2D модели снизу вверх эндоплазматического ретикулума.

Аннотация

Мы представляем удобный способ сформировать модель структурного органеллы снизу вверх для эндоплазменный ретикулум (ER). Модель состоит из весьма плотной липидный нанотрубок, которые, с точки зрения морфологии и динамика, напоминающие ER. Сети являются производными от фосфолипидов двойной бислоя мембраны патчи, придерживаясь прозрачной Al₂O₃ субстрата. Адгезия при посредничестве Ca^{2 +} в буфере окружающего. Последующего истощения Ca^{2 +} с помощью BAPTA/ЭДТА приводит Ретракция мембраны, что приводит к спонтанной липидов нанотрубок формирование сети. Этот метод только состоит из фосфолипидов и microfabricated поверхностей для простого формирования модели ER и не требует добавления белков или химической энергии (например, GTP или АТФ). В отличие от 3D морфология сотовой эндоплазматического ретикулума модель двумерной (хотя и поддерживаются размеры нанотрубок, геометрии, структура и динамика). Эта модель уникальной в vitro ER состоит только из нескольких компонентов, легко построить и можно наблюдать под микроскопом света. Результирующая структура может быть далее украшен для дополнительной функциональности, например добавления ER-связанных белков или частиц для изучения явления переноса среди трубы. Искусственные сети, описанные здесь являются подходящей структурных моделей для сотовых, ER, чьи уникальные характерные морфология было показано, быть связаны с его биологической функции, тогда как подробности относительно формирования трубчатых домена и перестановки в пределах понимаются все еще не полностью. Мы отмечаем, что этот метод использует Al₂O₃ микроскопия тонких пленочным покрытием coverslips, которые являются коммерчески доступных, но требуют специальных заказов. Таким образом желательно, иметь доступ к микротехнологий фонда для подготовки.

Введение

ER осуществляет важнейшие задачи в биологических клеток, включая сворачивание белков, синтез липидов и кальция регулирование^1,2. Морфология ER встроенных функций, которые она выполняет. Он сочетает в себе Вселенский стеки и плотной динамические трубчатых доменов, которые постоянно взаимодействуют с цитоскелета и проходят постоянное движение и перегруппировки. Некоторые ремоделирования, что ER структуры претерпевают включают в себя непрерывное преобразование между плоских листов и труб, образование пузырьков от или фьюжн ER люмен, удлинение существующие трубы, трубки стягивания, фьюжн и поломки³. Своеобразная структура трубчатых сетей напористо неблагоприятно. Путей и механизмов, в которых ER формирует и утверждает, что эта организация также, как это относится к своей функции не полностью осознана^4,5.

Известно, что ER неисправности когда он теряет свое состояние гомеостаза, что приводит к ER стресс, состояния, вызванные увеличение синтеза белка, накопление смятых протеинов, или изменения в Ca^{2 +} и окислительного баланс. ER стресс в свою очередь вызывает деформации естественных морфологии органеллы, специально, тревожным сетевые организации^6,7. Как ответ ячейка активирует механизм ремонта вернуться в состоянии гомеостаза. Неудача в ремонт может привести к апоптозу ER-индуцированной клеток, что способствует несколько метаболических и дегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, диабет 2 типа, болезни Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и несколько других^{7, 8}. Текущие исследования цели Организации трубчатых ER сетей, и несколько исследований сосредоточены на восстановлении ER в пробирке². Несколько существующих моделей^2,9,10 требуют белки инициировать и поддерживать мембраны кривизны^3,11 и помочь достичь свою форму органеллы. Очевидно модель системы, которые отражают некоторые из ключевых структурных и организационных особенностей ER и обеспечивают доступ к расширенные экспериментальных исследований пользуются большим спросом.

Мы представляем здесь процедур для подготовки снисходительный, белка/химической энергии свободной, динамичной в vitro модели ER, обеспечивая базовую платформу для изучения морфологии ER и связанных с ними функций⁴. В этом методе модель ER изготовлен с подхода снизу вверх, используя только несколько элементов, в которых молекулы интерес может быть интегрирована добавить сложности. Сеть представляет собой ER структуры и динамики. Кроме того обратимые преобразования между плоской мембраны и трубы, образование везикул от трубы, трубки фьюжн, раздвижные и втягивание все наблюдается. Помимо выступающей как модель снизу вверх для неполно понимается сотовой ER, липидов маршрут к сети нанотрубок, указанных в настоящем Протоколе может применяться для исследователей, изучая самостоятельной сборки, Нанофлюидика, сингл молекулы и коллоидной явления переноса, Marangoni потока и других связанных с этим областей. Только молекулярный строительных блоков, используемых в нашем методе являются фосфолипидов. Протокол требует мало лабораторных работ и основного оборудования и доступен для включения дополнительных элементов.

протокол

1. Подготовка фосфолипидного везикул подвеска

Примечание: Для всех материалов, упоминаемые как «чистые» в настоящем Протоколе, тщательно вымойте их изопропанолом следуют деионизированной водой и укладка феном их с азотом. Обратите внимание, что лечение стеклянных субстратов с сильноокисляющее кислых агентов (Пиранья раствор), которая обычно применяется в подготовке протоколов поддерживаемых липидной пленки на твердых субстратах, не должна выполняться на Al₂O₃-покрытием перевозчиков.

1. Место в чистой 10 мл круглым дном или инвертированный грушевидной формы стеклянную колбу: фосфатидилхолин холина (PC, 69% w/w), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДУРМАН, 30% w/w) и липидов конъюгированных Флюорофор выбора [например, Техас красный 1,2 - соевый L-α dihexadecanoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламина triethylammonium соли (TR-DHPE, 1% w/w)] в хлороформе; на сумму 3000 мкг липидов в 300 мкл хлороформ, что привело в конечной концентрации 10 мг/мл.
   Примечание: Использование чистой, стекло, газонепроницаемой шприцы с плунжеров политетрафторэтилена при обработке соединений, содержащих хлороформ.
   Предупреждение: Хлороформ токсичных и крайне неустойчивой и всегда должны рассматриваться под зонт с связанные средств индивидуальной защиты.
2. Подключите колбу роторный испаритель, положение с наклоном в 45 ° и медленно вращать на 24 об/мин внутри на водяной бане при 23 ° C для 6 h с давлением воздуха и полностью удалить хлороформ. Начало сокращения давления право после начала вращения с шагом 20 кПа каждые 2 мин, пока он не достигнет 20 кПа (150 Торр, 80% вакуум).
   Примечание: Формирование однородных липидной пленки равномерную толщину в подготовке судна является наиболее важным требованием для rotavap процедуры. Липидные препараты чувствительны к скорости вращения, быстрое давление изменяется и значение конечного давления; Поэтому строго следуйте шаги медленного сокращения, а также давление и вращение скорость конца. Расположите флакон с наклоном 45°, чтобы гарантировать, что торт обезвоженной липидов формируется равномерно, как фильм на стене колбу. Слишком быстро вращения приводит к турбулентности и слишком медленного вращения приводит (тяжести) к накоплению толстый слой жидкости в нижней части колбы. В течение последующих ночлега, отек процесс, очень inhomogenous липидов массы производится, также не реагировать на этапе окончательного sonication и результирующей дроби представляют различные композиции. Давления и времени в диапазоне, указанном в методе обеспечивает медленное desolvation. С хлороформом как растворитель слишком быстрое падение давления охлаждает вниз смеси, что приводит к увеличению вязкости и формирования статистических и неравномерным фильм. Длительного периода времени 6 ч рекомендуется для удаления растворителя для максимально, как органических растворителей разделы в материал липидов при регидратации.
3. После 6 часов остановить вращение и увеличить давление воздуха снова, постепенно, с шагом 20 кПа каждые 2 мин до достижения 100 кПа. Удаление фляга из роторный испаритель и добавить 3 мл PBS и 30 мкл глицерина. Слегка взболтать флакон распустить глицерина. Использование герметичные стеклянные пробки для уплотнения флакон, содержащий липиды.
   Примечание: Глицерин используется для предотвращения полного обезвоживания липидной пленки и позволяет бислой разделения¹². Она должна быть нагрета перед использованием, чтобы уменьшить ее вязкость, которая облегчает обработку этого соединения. Утепленные глицерина до сих пор не сразу смешать с PBS буфера. Нежный закрученного требуется до тех пор, пока полностью не растворится глицерина.
4. Настой Храните в холодильнике при 4 ° C на ночь для регидратации и отек липидной пленки.
5. На следующий день sonicate липидов с ультразвуковой водяной бане при комнатной температуре (RT, ~ 21 ° C) и частотой 35 кГц до достижения единообразного, слегка мутная липидов подвеска.
   Примечание: Sonication может занять около 10-30 с. длительное sonication (~ 1 мин) производит тепло и вредно для формирования пузырьков.
6. Шаги 1.1-1.5 доходность суспензии, содержащей два типа везикулярного структур: multilamellar везикулы (МЛВ) и гигантских однослойных везикул (GUV) (рис. 1А-1F).
7. Для хранения разделите подвеска липидов на 100 мкл аликвоты, с использованием в общей сложности 30 microcentrifuge трубок и хранить их в холодильнике при температуре-20 ° C.
   Примечание: Flash, замораживание жидким азотом не является необходимым и не используется до хранения. Протокол может быть приостановлена здесь. Оставляя липидов суспензий в холодильнике 4 ° C на длительное время причины липидов лизис, который влияет на состав мембраны.

2. Подготовка поверхности

Примечание: Следующий протокол выполняется на чистых, классифицируются как ISO 8 в спецификации стандарта ISO 14644-1. Атомно-слоевого осаждения (МОП) используется для изготовления Al₂O₃ субстратов. Параметры указанного процесса зависят от инструмента и может варьироваться между различными моделями оборудования. Они могут использоваться в качестве начальных параметров для разработки процесса.

1. Установите температуру ALD реактора до 200 ° C.
2. В зале образца вместе с кремниевой пластины, который будет использоваться позже как опорная поверхность для определения толщины осаждения Эллипсометрия Загрузите стеклянных поверхностей (например, стекла coverslips).
   Примечание: Стеклянные подложки используются out-of--box и не очищены растворителя перед осаждения. Они только были сброшены с газом азота для удаления частиц.
3. Эвакуировать грузового пространства до 400 ПА (3 Торр) и передавать образцы в камеру основной реакции и эвакуировать в 200 Па
   Примечание: Температура реактора должна поддерживаться на 200 ° C для надлежащего осаждения. Колебания температуры после того, как достижение загрузки образца в равновесного с уровня продуктов, должна быть поэтому перед запуском процесса осаждения. Давление в камере установлен быть выше, чем реактор давление, чтобы избежать каких-либо прекурсоров для распространения за пределами камеры.
4. Начало сдачи атомной фильм. Один цикл состоит из 150 мс пульс триметил алюминия экспозиции, следуют 1 s продувки и впоследствии, H₂O воздействия продолжительностью 200 мс, следуют 1 s продувки.
   Примечание: Все настройки, включая камеры и реактор давление, продолжительность циклов и удаляет автоматизированы достичь определенных темпов осаждения. Эти параметры могут различаться между различными моделями оборудования. Предварительно настроенные рецепты часто подготовлен продавцом или инструмент ответственные в чистой комнате и передаются пользователю как хранение пленки толщиной в единицу времени.
5. Достичь 10 Нм Al₂O₃ на подложке, повторите этот процесс для 100 циклов. Количество циклов зависит скорость осаждения, который может варьироваться между различными рецепты или оборудования.
6. Чтобы удалить образцы из реактора, первый вентиляционные камеры до тех пор, пока его давление достигает атмосферное давление, затем удалите образцы.
7. Храните образцы в герметичные контейнеры на RT до использования.
   Примечание: Никаких дальнейших очистки рекомендуется перед использованием. Протокол может быть приостановлена здесь.
   Примечание: Образцы в идеале должны использоваться сразу же после осаждения. Оптимального хранения требует позиционирования поверхностей внутри полипропиленовые вафельные перевозчиков, следуют обертывающей перевозчиков в чистой комнате совместимых пластиковые пакеты, которые должны быть азота покраснел до вакуумные упаковочные. Цель заключается в том, чтобы не подвергать поверхность переносимых по воздуху загрязнителей. При необходимости, поверхности может храниться в герметичные контейнеры на RT на максимум на 5 дней. Не рекомендуется использовать более длительного хранения. Для пользователей, которые не имеют легкий доступ к чистой комнате рядом и приобрести или получить поверхности из-за рубежа, повторно окисляющих субстратов с помощью кислородной плазмой или озоном лечения может быть альтернативным решением¹³.

3. Преобразование молекулярных фосфолипидного фильмов для трубчатых сетей

1. Оттепель подвеска липидов и передачи 4 капли мкл суспензии на чистое стекло микроскопа слайд/coverslip.
2. Забираются капли за 20 мин. Капелька рухнет в плоских круговых фильм липидов после высыхания, который является видимым для глаз.
3. Увлажняет липидной пленки с 1 мл HEPES буфера (см. Таблицу материалы) за 3 мин.
   Примечание: Объем буфера для регидратации влияет плотность везикул подвески (количество пузырьков на единицу объема), которая впоследствии переведен в камеру наблюдения. В зависимости от объема камеры наблюдения и плотности желаемого везикул, регидратации тома могут быть настроены до 0,5-1 мл. Чистой боросиликатное слайды, как правило, поддержка капельки нескольких сотен микролитров до 1,5 мл без проблем. Так как coverslip не должны быть перемещены, это не приводит к технической проблемы. На более гидрофобных поверхностей, таких как Су-8 полимерным покрытием слайды даже 1,5 мл может быть хранение¹².
   Примечание: Липиды должен быть свежеприготовленный, как воздействие Регидратированные липидов фильма для более чем 20 мин на RT приводит к испарения буфера и частично обезвоживание ранее Регидратированные пузырьков, который водит к плохо определен состав.
4. Подготовка камеры наблюдения: возможность для буфера обмена посредством автоматические пипетки, которое требуется инициировать преобразование ER, был использован камеру наблюдения с открытым верхом. Эта палата состоит из рамы полидиметилсилоксан (PDMS) с размерами, которые 1,5 x 1,5 x 0,5 см, придерживались на Al₂O₃ на хранение coverslip. В Рисунок 1Gпредставлена схема навесные наблюдения камеры. Изготовить PDMS кадра и собрать камеры наблюдения были выполнены следующие шаги:
   1. Приготовляют раствор Кох, смешивая 100 г KOH с 100 мл изопропанола в стакан в ледяной бане. Перемешайте 10 h или дольше, пока Кох полностью не растворится, используя магнитную мешалку и Плиты магнитные перемешать.
      Предупреждение: Кох решение обладает коррозионными свойствами и может привести к ожоги кожи, поэтому следует всегда обрабатывать с надлежащего личного защитного оборудования.
      Примечание: Растворимость Кох в изопропиловый спирт не так высок, как в воде. Растворения экзотермические. Дробления гранул Кох до растворения и непрерывном помешивании является целесообразным.
   2. Опускайте стекла Петри (d = 6 см) в раствор Кох в RT и держать его на ночь.
   3. На следующий день, снимите стеклянную посуду из раствора, погружать его в контейнер с дейонизированной воде 5 минут, промойте его несколько раз с водой и поместите его в сушильном шкафу при 80 ° C для 1 h. удар поверхности кратко с потоком азота для обеспечения что часть Icles будут удалены.
   4. Для пассивации поверхности и предотвращения склеивания для PDMS, передачи 200 мкл диметилдихлорсилана с Пластиковый шприц в чистый пластиковый контейнер как лодку взвешивания.
   5. Храните стекло Петри блюдо вместе с силан на 1 ч в эвакуированных Эксикатор (низким вакуума, ~ 20 кПа).
      Предупреждение: Диметилдихлорсилана токсичных и всегда должны рассматриваться под зонт с связанные средств индивидуальной защиты.
   6. Подождите 15 минут прежде чем собирать Петри в порядке для оставшихся диметилдихлорсилана пара рассеиваться. Петри в настоящее время silanized, и поверхности гидрофобные.
      Примечание: Быстрый способ для проверки успех этого шага заключается в место капли воды на silanized Петри. Контактный угол капли с поверхностью явно необходимо увеличить по сравнению с необработанными стекла.
   7. В 250 мл пластиковый контейнер (прозрачный пластиковый стаканчик свежим из пакета) Смешайте 10 г силиконового эластомера базы с 1 g отвердителя Эластомеры силиконовые (10:1). Перемешайте с помощью шпателя пластиковых мешалки/пластик на 5 мин.
      Примечание: Воздушные пузырьки образуются при помешивании, а PDMS будет выглядеть бледно белый.
   8. Забираются смесь Дега < 20 кПа, до тех пор, пока рухнули все расширяющейся пузырьков воздуха (высокий вакуум ускоряет процесс). Вылейте смесь дегазации в silanized Петри.
   9. Лечение при 65 ° C, 2 часа в духовке.
      Примечание: Это позволяет удвоить скорость отверждения путем повышения температуры > 95 ° c. Повышении температуры полимеризации приводит к увеличению жесткости материала.
   10. Охладить Петри, наполненный вылечить PDMS для RT и удалить PDMS плиты с помощью шпателя.
   11. С помощью скальпеля нарежьте кадра размеры и геометрия для доступных открытия в микроскопа. Габаритные размеры (длина) 1,5 x 1,5 (ширина) x 0,5 см (высота) подходят для большинства установок.
   12. Принесите гладкой стороной (нижней стороне, который был в контакте с Петри) из PDMS кадр контакт с активной стороне поверхности где проживает Al₂O₃ фильма и осторожно применять давление раздвинуть рамки и поверхности друг против друга чтобы сделать их придерживаться.
       Примечание: Адгезии между PDMS и Al₂O₃ субстрата является слабой. Наличие воздушных пузырей на интерфейсе контакт может привести к де привязанности и, следовательно, утечки буфер и связанное содержимое. PDMS кадр может использоваться несколько раз, если сразу после и до каждого использования, которую он ополаскивается изопропанолом, следуют промывка водой ди и сушка феном с азотом. Silanized Петри также может быть повторно использован.
5. Заполнить камеры наблюдения с Ca^{2 +}- HEPES буфера (см. Таблицу материалы).
   Примечание: Поверхность должна использоваться сразу после вскрытия пакета. Контакт с воздухом приводит к адсорбции загрязняющих веществ, которые постепенно уменьшается активность поверхности. Камеры должны быть заполнены буфера сразу же после Ассамблеи. Не заполнять всю камеру объем для добавления Регидратированные липидов на последующем шаге.
6. Установите камеру на сцену конфокального микроскопа. Перевод материала Регидратированные липидов, теперь суспензии, содержащей гигантских везикулы, в камеру с Пластиковая пипетка Пастера (рис. 1A-1 G).
7. Подождите 10-20 мин, чтобы пусть везикулы присоединиться на подложку и распространилась по всей поверхности (рис. 1H-1J).
   Примечание: Распространение начинается сразу же после осаждения липидов на поверхности. Скорость распространения может немного варьироваться в зависимости от состав липидов, Al₂O₃ осаждения техники (ADL, RF-напыление, химическое парофазное осаждение, и т.д.), свежесть субстрата и двухвалентной катиона концентрация в буфер. Убедитесь, что буфер обмена выполняется перед сверлении распространения патчей¹⁴.
8. После наблюдения, несколько липидов распространяется медленно извлеките окружающего буфера через автоматические пипетки, таким образом, что только тонкий буфера фильм остается на дне.
   Примечание: Быстрое удаление буфера возмущает липидные структуры на поверхности.
9. Перейти к окружающего буфера обмена, медленно заполняя камеры наблюдения с буфером хелатором HEPES (см. Таблицу материалы) с использованием автоматических дозаторов (рис. 1K).
   Примечание: Резкое добавление буфера возмущает липидные структуры на поверхности.
10. Это последний шаг дает динамический nanotubular сетей, образовавшихся в результате хелатором индуцированной depinning и втягивания DLBM MLV⁴ (L-1Yрис. 1).

4. микроскопии наблюдения

1. Приобрести изображений с Перевернутый лазерного сканирования конфокального микроскопа с помощью 40 X цель погружения нефти (1.3 NA) с частотой сканирования 400 Гц. нанимать белого света лазерный источник для возбуждения DHPE красный Техас в 595 Нм. Собирать эмиссия от 605 до 700 нм с помощью детектора фотонного гибрид.
   Примечание: в качестве альтернативы, epi флуоресцентным микроскопом может использоваться для обработки изображений. В зависимости от имеющихся источников света выберите соответствующий липидов краситель конъюгата.

Результаты

Липидов подвески, полученный на шаге 1 протокола и используется во всем экспериментов содержит два основных типа пузырьки: MLVs и GUVs. Рисунок 1 A-1F показывает лазерного сканирования конфокальной микроскопии везикулы в первоначальной выборки, построенный в 3D. Рисунок 1 A-1_C показывает MLV (липидов депозит) в xyz, xz и плоскости yz, соответственно. Рисунок 1 D-1F показывает аналогичные виды гигантских однослойных везикул (GUV). Внутренняя часть GUVs, которых не хватает multilamellarity, полые; Следовательно липидов материал для распространения значительно ограничен. Таким образом только полезным липидов водохранилищ для данного метода являются MLVs.

Когда подвеска липидов передается в камеру наблюдения, содержащую Ca^{2 +}- HEPES буфера (рис. 1G), MLVs (рис. 1A-1_C) начинают селиться на поверхности Al₂O₃ . После контакта везикулы присоединиться к поверхности, и круговой плоский двойной липидного бислоя мембраны (DLBM) начинает распространяться от каждого MLV на твердой поддержки (Рисунок 1H-1J). MLV действует как резервуар, который предусматривает постоянно расширяющейся DLBM липиды. Дистальный (верхний) бислоя мембраны, в отношении твердой поддержкой, подключен к проксимальной (Нижняя) бислоя мембраны вдоль окружности краю круговой, выполняя подвижного движения (рис. 1я). Два бислоев категорически расположены поверх друг друга, только имея тонкопленочных жидкость, инкапсулированные между ними. Во время распространения, проксимальной мембраны постоянно придерживается опорной поверхности под, в то время как Дистальная мембраны боково вытащил на краях по краю расширение проксимального мембраны. Распространение DLBM при посредничестве Ca^{2 +}, который действует как агент fusogenic между липидов головы группами от проксимальных мембраны и твердый субстрат⁴.

Если распространение продолжается длительное время, мембраны напряжение увеличивается, приводит к разрывам (рис. 2A и 2B). После этого, втягивание мембраны, которая необходима для создания ER трубчатых морфологии, больше не может быть наведено. Таким образом важно признать нарушение плодной оболочки. Так как дневно помечены липидов в наших экспериментах, сверлении можно непосредственно наблюдать. Ключевым показателем сверлении является значительное снижение интенсивности флуоресценции в разрыв региона (рис. 2A и 2B)¹⁴. Сверлении является результатом возросшей напряженности и последующих порообразования в дистальной части мембраны. Под микроскопом флуоресцентные разорванные регионов представят поэтому половину интенсивности выбросов (один проксимальный бислой) неразорвавшийся регионов (двойной бислой)¹⁴ (рис. 2B). Во время порообразования мембранный материал, который был первоначально позиционируется на разорванные регионов, переносит к краям распространяя патч. Это в свою очередь вызывает рост области общей патч. Таким образом быстрое расширение контура круговой патч может также наблюдаться при сверлении.

Чтобы избежать экстенсивного роста, ведущего к разрыву патчи, сразу же после того, как зона круговая патч достигает 100-200 мкм, Ca^{2 +}- HEPES буфер осторожно удаляется с автоматические пипетки до тонкой пленкой жидкости остается на поверхности. Хелатором-HEPES буфер осторожно добавляется к камере начать Ретракция (рис. 1K). Полное обезвоживание образца (рис. 2C) или быстрого обмена буферов (Рисунок 2D и 2E) вызывает беспорядки, сверлении или деформации патчей. Добавление хелаторов постепенно удаляет Ca^{2 +} из пространства между поверхностью и мембраны. Хелатором-HEPES буфер постепенно обращается к bilayer-подложка пространства, начиная от периферии патч мембранных липидов. Таким образом, снятие закрепления сайтов начинается от краев круговая патч и распространяет внутрь (рис. 1K-1 квартал). В результате depinning, мембранных липидов начинает отсоединения и отказаться от края внутрь, движется к MLV в центре. Ретракция процесс приводит к новым интерфейсом динамично развивающихся липидный трубчатых сетей⁴ (L-1Yрис. 1). Стойких регионах закрепления, которые не позволяют мембраны для отсоединения полностью, остаются на поверхности и nucleate табулирования, ведущих к давно разветвленной сети нанотрубок. (Рисунок 1L-1Y). Непрерывная снять закрепление и дальнейшее Ретракция липидов нанотрубок наблюдаются с течением времени в результате процесса постепенного комплексообразования. Этот огрубление и перегруппировки сети филиалов играет ключевую роль в динамическое поведение трубчатых сетей, которые напоминают гладкой ER.

Рисунок 1 L-1Y показывает микроскопии сетей нанотрубок, полученные в протоколе. Рисунок 1 L является крупным планом региона в Рисунок 1М отмечен в белой рамке. Непрерывная ярко красный регионы в Рисунок 1Л и 1 M являются втягивания фракция DLBM (помечены синей пунктирной линией на рис. 1M). Микрофотография трубчатых сети в Рисунок 1N и 1O Перевернутый для увеличения контрастности. Рисунок 1 P и 1 квартал изображает сокращение трубчатых плотности на мембраны региона в течение 3 ч. и 20 мин. Снижение плотности трубчатых происходит за счет постепенного depinning следуют втягивания DLBM от поверхности в экспериментальный период. Со временем, количество точек, освободившись от закрепления увеличивается, привело к реорганизации и сокращения района, охватываемого трубы (рис. 1P и 1 квартал). Трубчатые перестановки мотивированы минимизация липидов нанотрубок, взвешенных между двумя фиксированных точек поверхности свободной энергии. Это прочные, что наиболее эффективным способом свести к минимуму поверхности энергии нанотрубки является сокращение ее длина¹⁵. Поэтому когда fusogenic регионы, которые первоначально нанотрубки на поверхности, снятие закрепленного, нанотрубки слайд и аранжируют спонтанно, приняв минимальная длина. Эти перестановки вызывают постепенно снижение освещение поверхности нанотрубок (рис. 1P и 1 квартал).

Мы не можем визуализировать Ca^{2 +}-опосредованной закрепления точек, но мы определяем их расположения как точки, где трубы у терминала или острые повороты. Резкие повороты, называются V-развязок¹⁵ или точки поворота причине резкий сдвиг в направлении выравнивания трубку (зеленые стрелки на рисунке 1R и 1 X). Конечная точка представляет конечной трубки, которая предотвращает трубки от втягивания (оранжевые стрелки на рис. 1X). В ходе реорганизации, энергетически благоприятных распоряжения трубок, определены как «Y-соединения» или «3-way узлов», появляются. Y-переход соединяет три трубки с приблизительно 120° углы между каждой трубы, где короткие длина всего трубки может быть обеспечено. Y-узлов, которые не обладают конечной точки и вместо этого расположены между несколькими нанотрубок, не закреплена. Это единственный тип Y-Джанкшн, который может выполнять скольжения (синие стрелки, Рисунок 1R). Как показано на рисунке 1R и 1S, раздвижные Y-Джанкшн вдоль весьма нестабильных пересечения приводит к формированию двух отдельных Y-развязок (синие стрелки на рисунке 1S). Пунктирная линия белая, наложенное на Рисунок 1S представляет контуре фрагмента трубчатых сети в Рисунок 1R. Небольшая часть Y-узлов обладает конец терминалы (желтая стрелка на рисунке 1Т), которые, со временем, в конце концов отказаться (рис. 1U). Трансформации V-переход на единый, Прямая трубка depinning из точки пересечения двух линейных сегментов и опровержение одной из труб, образуя форму V можно наблюдать в Рисунок 1V и 1W и Рисунок 1X и 1Y, соответственно.

Рисунок 1 : Преобразование липидов депозитов ER-как трубчатые сетей. (A-F) Лазерное сканирование конфокальной микроскопии везикулы в первоначальной выборки, построенный в 3D. (A-C) Пузырек multilamellar липидов (MLV, липидов депозита) в xyz и xz, yz самолетов, соответственно. (D-F) Подобные взгляды гигантских однослойных везикул (GUV). Внутренняя часть GUVs впадина, которая делает липидов материал для распространения значительно ограничены. Полезные липидов водохранилищ для этого метода являются поэтому MLVs. (G) Иллюстрация камеры наблюдения, монтируется на инвертированным микроскопом, на который зачисляются буфер и липиды. Камера состоит из PDMS кадра присоединились на Al₂O₃ покрытием coverslip, обеспечивая верхней открытой тома. (H-J) Иллюстрация распространяющегося явления MLV присутствии Ca^{2 +}. (H) при контакте с Al₂O₃МЛВ спонтанно распространяется в виде циркуляра, липидного бислоя мембраны (DLBM). (I) схема сбоку DLBM в плоскости xz, где периферии выполняют подвижного движения. MLV (d = 5-15 мкм) и DLBM (толщина = 10 Нм) не обращается к шкале. (J) конфокальный Микрофотография разбрасывания DLBM с топ зрения. (K) описывает основной шаг настоящего Протокола, где буфер обмена один содержащие Ca^{2 +} хелатирующие агенты, сдерживающих распространение, вызывая втягивания DLBM MLV и ведет к формированию нанотрубок липидов. (L-Y) Микроскопии сетей нанотрубок, полученные с помощью метода описано. (L) макро региона в (М) отмечен в рамке. Непрерывное регионов ярко красный (L и M) представляют собой DLBM (также помечены синей пунктирной линией в М). Микрофотография трубчатых сети (N и O) является инвертированным для увеличения контрастности. (P и Q) Изображением сокращения трубчатых плотности на мембраны региона в течение 3 ч 20 мин (R-Y) представитель трубчатых повторного договоренностей. (R и S) Раздвижные, (T и U) переходит Y-Джанкшн в V-Джанкшн опровержение одной конечной точкой и (V и W) снятие закрепления переломного момента, что привело к ликвидации V-Джанкшен. (X и Y) Ретракция конечной точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Потенциальные негативные результаты. (A и B) Сверлении дистальной части мембраны из-за долгое время ожидания до обмена буферов. Разорванные районы, где проксимальной мембраны становится видимым, появляются как темные области по сравнению с регионами неразорвавшийся дистальной части мембраны. Врезные для группы B показывает интенсивность света вдоль синей стрелкой на Микрофотография. Интенсивность области разрыва мембраны (проксимальной/сингл бислой становится видимым) соответствует половину интенсивность неразорвавшийся мембраны (дистальной/Двухместный бислой). (C) внешний вид сухой липидов патч сформированным удаления всех жидкости из камеры наблюдения. (D и E) Нарушение мембраны путем оперативного обмена буферов через автоматические пипетки. В (D) МЛВ разделена на 2 MLVs, ведущих к патч не круглое, деформированных липидов. (Е) шаблон потока (стрелки), созданная сильная инъекции хелатором HEPES буфера, отражается на структуре tubulated мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

В ходе последовавшего обсуждения описаны важные шаги, возможные изменения и ограничения протокола. Первым важным шагом является надлежащее Ассамблея камеры наблюдения, учитывая, что адгезии PDMS кадра на Al₂O₃ поверхность неразрывно слаба. В случае, где кадра не прилегали к подложке содержание будет вытекать из камеры для наблюдения и эксперимента будет прийти к остановке. Основные факторы, которые препятствуют надлежащей герметизация поверхности и рамка 1) является отсутствие тщательной очистки (повторно используется) PDMS кадра и 2) воздушные пузыри, которые иногда получить в ловушке между рамой и субстрата. Следует использовать рамку PDMS недавно подготовленных или тщательно очищены. Рамы следует промыть до и после каждого использования изопропанолом, следуют промывка водой ди и сушка феном с азотом. Al₂O₃ поверхности не требуют предварительной очистки, так как они изготавливаются в среде чистых и хранится в герметичных контейнерах до использования. Благодаря Амфотерные характер Al₂O₃оно не должно подвергаться настоятельно кислой или основные решения. Другие проекты для камеры наблюдения могут использоваться, в зависимости от доступности отдельных установки. Важные особенности этой палаты являются свободный доступ к жидкого образца с открытым верхом и инертность материала рамы в отношении используемых решений и образцы. Размеры камеры также являются важным фактором, поскольку они должны учитывать объёмом от 0,5 до 1 мл. Поскольку используемые поверхности обычно стандартного размера coverslips (24 x 60 мм), объем камеры главным образом определяется толщина рамы. К нашему знанию прокладки с учетом размера и глубины, которая может вместить образец томов, обычно обрабатываются в настоящем Протоколе не коммерчески доступных. Мы поэтому посвятил раздел в протоколе детали изготовления и сборки камеры выборки.

Другим важным шагом в этом протоколе является буфером обмена. На этом шаге проблема сроков, необходимых для выполнения этого обмена. Распространение MLV при контакте с Al₂O₃ субстрат мгновенного, и постоянное расширение DLBM приводит к его сверлении, Завершение эксперимента (рис. 2A, B). Таким образом следует постоянно контролировать распространение, и буфера обмена должны выполняться своевременно. Обмен не должно выполняться слишком быстро после инициализации распространения, с тем чтобы позволить мембраны патчи для достижения оптимального размера (100-200 мкм в диаметре). С другой стороны непрерывное прилипания на поверхности приводит к высокой мембраны напряженности, которая ведет к сверлении. Таким образом все мембраны патчей в конечном итоге разрыв, если распространение не прерывается. Сроки сверлении отличается для каждого патч, так как это зависит от размера и внутренняя структура MLV и доступности липиды нем. Следовательно на момент обмена следует организовать до timepoint, на которой ООН разрыв патчи с оптимальных размеров представляют большинство всего населения. Еще одна проблема в буфер обмена шаг является скорость удаления и добавления буферов. Выполнения этой подстановки слишком быстро имеет пагубное влияние на окончательный мембранных структур (рис. 2C-E). Чрезмерная добыча Ca^{2 +}- HEPES буфера, не оставляя тонкую пленку жидкости на подложке, приводит к сушеные и необратимо испорченный мембраны патчи (рис. 2C). Даже если надлежащее количество жидкости поддерживается на поверхности, резкое добавление буфера хелатором-HEPES также вызывает возмущений мембранных структур. Рисунок 2 D,E показывает типичный вид эжекции нарушается мембраны патчей. Общие морфологические нарушения не обязательно влияют динамические свойства окончательные структуры (т.е., трубчатые перестановки в оставшихся районах по-прежнему будет происходить). Однако он станет трудно наблюдать за материальное преобразование на деформированной структуры. Например Рисунок 2D, было бы сложно определить направление, к которому убирается MLV DLBM.

Один из возможных изменений протокола является состав липидов используется. Основное внимание уделялось фосфолипидов, которые доминируют состав ER в млекопитающих и дрожжей¹⁶ (е. g., фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилинозитол (PI). Оригинальные эксперименты были проведены с использованием ПК и PI смеси⁴. В представленные результаты была использована смесь PC и ДОПИНГ и производная PE. Однако не все произвольные липидной композиции были найдены для создания трубчатых структур, полученные через этот протокол. Несколько других смесей экспериментально исследованы липидов включают всего сердца экстракт, экстракт фасоли сои Полярный, E. coli экстракт полярных, смеси ПК с stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) в различных соотношениях и смеси из Серина (PS) PC-PE-Пи-Posphatidyl в различных соотношениях. Поскольку структуры трубчатые мембраны обладают высокой кривизны и требуют специальных расположение молекул отдельных липидов, ожидается, что наблюдаемое явление является липидного состава конкретных.

Еще одно изменение, применяемые в настоящем Протоколе является метод для изготовления поверхности. Здесь МОП была использована для изготовления Al₂O₃ с покрытием coverslips. Это отличается от метода первоначально сообщалось осаждения, реактивного распыления⁴. Хотя это указывает, что метод альтернативного поверхности изготовление по-прежнему может привести к ER-как Штенгель, одно важное ограничение, как представляется, специфики поверхности материала. Режим распространения и прочность сцепления сильно зависит от свойств поверхности материала, которые влияют такие факторы, как электростатических взаимодействий, смачиваемость, гидрофобность и шероховатости поверхности. Al₂O₃ поверхности обеспечивают оптимальный адгезионная прочность, и липидной пленки можно оба придают достаточно сильно распространилась как двойной липидного бислоя мембраны и отсоединить формы трубчатых сетям после удаления ионов Ca^{2 +} . Ранее мы тестировали же эксперимент с SiO₂, в котором multilamellar везикулы распространения как двойной липидного бислоя мембраны, но не трубчатых сети формирование наблюдалось при добавлении хелаторов¹⁷. Только на Al₂O₃ наблюдаются де вложений и трубку или плазменного травления Аль¹⁸. Наши исследования показали, что параметр войска, ведущие к такое явление является Зета потенциал поверхностей, для которых Аль и Al₂O₃ были близко к нулю (mV) и SiO₂ значительно отрицательным. Зета потенциал боросиликатное похож на SiO₂¹⁹; Таким образом адгезии липидной пленки на боросиликатное столь же сильным и необратимым. В самом деле multilamellar липидов водохранилище контакт с поверхностями боросиликатное обычно приводит к немедленному разрыва и формирования одного липидных бислоев²⁰. Al₂O₃ поверхности требуется для этого протокола не легко или коммерчески доступных. Они могут однако, быть пользовательские приказал от производителей стекла и субстрат специальности. Доступ к чистой комнаты с оборудованием производства тонкопленочных настоятельно рекомендуется.

Другие существующие методы снизу вверх для изготовления трубчатых сети ER-как^2,10 включать белки, а также ввода химической энергии (например., GTP и АТФ). Рапопорт и коллеги² сообщили формирование ER-сетей на стекло coverslips в пробирке путем смешивания мембраны изгиб белков, присутствующих в ER, фосфолипидов и ГТФ. Работы по Bachand и др. ¹⁰ показано, как такие динамические трубчатых сети могут быть созданы с помощью молекулярных моторов и СПС как источника энергии. Этот протокол представил не требуют мембранных белков или гидролиза органических соединений для энергетики. Только основные компоненты являются твердый субстрат и фосфолипидов. Очистки и извлечения белков не требуются. Этот протокол обеспечивает, с точки зрения простоты составных молекул, самой простой модели ER.

С этой основной, на основе липидов ER модель создана здание вверх сложности путем добавления ER-связанный компонентов представляет интерес, так как он позволяет расследования отдельных воздействия на систему. Подобно к фактической ER сетей, трубы в модели являются динамическими. Спряжение для и миграции помечены мембранных белков, или флуоресцентные частицы во всей трубчатой сети, может дать информацию о направлении движения мембраны. Инкапсуляция и мониторинг флуоресцентный жидкости внутри DLBM и трубы во время преобразования и возможное сопоставление внутриканального контента транспорта может служить еще одним направлением. Наконец переход от 2D модели ER, в результате этого протокола к 3D гладкая модель ER может быть принят путем инкапсуляции сетей в архитектурах гидрогеля.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pear-shape flask 10 mL	Lenz Laborglasinstrumente	3.0314.13	In which the lipid mixture is prepared
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N)	Hamilton	P/N81520	For transfer of the chloroform to beaker
Custom large hub needle Gauge 22 S	Hamilton	7748-18	Removable needle for syringe specified in row 3
Hamilton 250 µL glass syringe	Hamilton	7639-01	Used for transfer of lipids in chloroform to the flask
Large hub Gauge 22 S	Hamilton	7780-03	Removable needle for syringe specified  in row 5
Hamilton 50 µL glass syringe	Hamilton	7637-01	Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask
Small hub Gauge 22 S	Hamilton	7770-01	Removable needle for syringe specified in row 7
Chloroform anhydrous (≥99%)	Sigma-Aldrich	288306	Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC)	Avanti Polar Lipids Inc	441601	phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids Inc	850725	phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI)	Avanti Polar Lipids Inc	840044	alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017)
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE)	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	T1395MP	Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture
Digital Dry Baths/Block Heaters	Thermo Fischer	88870006	To warm glycerol in order to decrease its viscosity
Glycerol for molecular biology (≥99%)	Sigma Life Science	G5516	For lipid preparation
PBS buffer  (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21			Used to prepare the lipid suspension
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%)	Sigma Life Science	T1503	Used to prepare PBS buffer
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4)	Sigma-Aldrich	P5629	PBS buffer ingredient
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O)	Sigma Life Science	63138	PBS buffer ingredient
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	795488	PBS buffer ingredient
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA)	Sigma-Aldrich	E4884	PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient
Ultrasonic cleaner USC-TH	VWR	142-0084	Ultrasonication of rehydrated lipids
Rotary evaporator  -  Büchi rotary evaporator Model R-200	Sigma	Z626797	For evaporation of chloroform
Pressure meter - Vacuum regulator IRV-100	SMC	IRV10/20	For controlling the pressure value during lipid dehydration
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27			Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water
HEPES ≥99.5% (titration)	Sigma Life Science	H3375	HEPES-buffer ingredient
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl)	Sigma Life Science	S3014	HEPES-buffer ingredient
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29			Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2)	Sigma Life Science	C5670	To prepare Calcium-HEPES buffer
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31			Used to promote the formation of tubular networks.  Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4)	Sigma Life Science	14513	Chelator-HEPES buffer ingredient
Sodium Hydroxide	Sigma	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
pH meter accumet™ AE150 pH	Fisher Scientific	1544693	Used to measure the pH of all buffers
Glass petri dish	VWR	HECH41042012	6 cm, used for making the PDMS sheet
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH)	Sigma-Aldrich	221473	To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet
Isopropanol prima ren 99.5%	Antibac AS	600079	KOH solution ingredient
Heating and drying oven - venticell	MMM Medcenter Einrichtungen GmbH	MC000714	For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS
Dichlorodimethylsilane ≥99.5%	Sigma-Aldrich	440272	Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-79202-05	Connected to desiccator
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent	Dow corning	24236-10	Kit to make PDMS solution
Sylgard 184 Silicone elastomer base
Disposable scalpel	Swann-Morton	11798343	Used to cut the PDMS
Cover slips	Menzel -Gläser	MEZ102460	24x60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3
Atomic layer deposition system	Beneq	TFS200 (model number)	Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass
Ellipsometer	J.A. Woollan Co.	Alpha-SE (model name)	System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface
Laser scanning confocal  microscope	Leica Microsystems	Leica TCS SP8 X	Microscope used for visualization of the experiment
Objective 40x, 1.3 NA	Leica Microsystems	1550635	Used for visualization of the experiment
White light laser source	Leica Microsystems	Leica TCS SP8 X	For excitation of the membrane fluorophore