Сочетание мультиплексной флуоресцентной гибридизации in situ с флуоресцентной иммуногистохимией на свежезамороженных или фиксированных срезах мозга мышей

Резюме

В этом протоколе описывается метод сочетания флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и флуоресцентной иммуногистохимии (IHC) как в свежезамороженных, так и в фиксированных срезах мозга мышей с целью получения мультиметочного FISH и флуоресцентного сигнала IHC. ИГХ нацелен на цитоплазматические и мембранные присоединенные белки.

Аннотация

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это молекулярный метод, который определяет наличие и пространственное распределение специфических транскриптов РНК в клетках. Нейрохимическое фенотипирование функционально идентифицированных нейронов обычно требует одновременного мечения несколькими антителами (белком-мишенью) с использованием иммуногистохимии (ИГХ) и оптимизации гибридизации in situ (таргетная РНК) в тандеме. Может быть достигнута «нейрохимическая сигнатура» для характеристики конкретных нейронов, однако осложняющие факторы включают необходимость верификации мишеней FISH и IHC перед объединением методов, а также ограниченное количество РНК и белков, которые могут быть нацелены одновременно в пределах одного и того же участка ткани.

Здесь мы опишем протокол, использующий как свежезамороженные, так и фиксированные препараты мозга мышей, который обнаруживает несколько мРНК и белков в одном и том же участке мозга с помощью РНК-скопа FISH с последующим флуоресцентным иммуноокрашиванием, соответственно. Мы используем комбинированный метод для описания паттерна экспрессии мРНК с низкой распространенностью (например, рецептор галанина 1) и мРНК с высокой распространенностью (например, транспортер глицина 2) в иммуногистохимически идентифицированных ядрах ствола мозга.

Основные соображения по маркировке белков после анализа FISH выходят за рамки подготовки тканей и оптимизации маркировки зондов FISH. Например, мы обнаружили, что на связывание антител и специфичность маркировки может отрицательно влиять стадия протеазы в анализе FISH-зонда. Протеазы катализируют гидролитическое расщепление пептидных связей, облегчая проникновение FISH-зонда в клетки, однако они также могут переваривать белок, на который нацелен последующий анализ ИГХ, вызывая нецелевое связывание. Субклеточное расположение целевого белка является еще одним фактором, способствующим успеху ИГХ после FISH-анализа. Мы наблюдали, что специфичность ИГХ сохраняется, когда белок-мишень связан с мембраной, в то время как ИГХ, нацеленная на цитоплазматический белок, требует обширного устранения неполадок. Наконец, мы обнаружили, что работа с фиксированной замороженной тканью, установленной на предметном стекле, более сложной, чем со свежезамороженной тканью, однако качество ИГХ было в целом лучше с фиксированной замороженной тканью в сочетании с РНК-скопом.

Введение

Белки и мРНК, которые нейрохимически определяют субпопуляции нейронов, обычно идентифицируются с помощью комбинации иммуногистохимии (ИГХ) и/или гибридизации in situ (ISH) соответственно. Сочетание ISH с методами ИГХ облегчает характеризацию паттернов колокализации, уникальных для функциональных нейронов (нейрохимическое кодирование), максимизируя способность мультиплексного мечения.

Флуоресцентные методы ISH (FISH), включая RNAscope, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с более ранними методами детектирования РНК, такими как радиоактивный ISH и нерадиоактивный хромогенный ISH. FISH позволяет визуализировать одиночные транскрипты мРНК в виде точечных пятен¹. Кроме того, анализ РНК-скопа позволяет одновременно маркировать увеличенное количество мишеней РНК, используя различные метки флуорофора. Несмотря на эти преимущества, технические ограничения могут повлиять на количество флуорофоров/хромогенов, которые могут быть использованы в одном эксперименте. К ним относятся наличие комплектов фильтров для микроскопов; Такие соображения усугубляются, когда нейрохимическая идентификация использует комбинированные FISH и IHC, по сравнению с использованием каждого метода по отдельности, поскольку неотъемлемые шаги, оптимальные для одного метода, могут быть вредными для другого.

Предыдущее применение FISH в сочетании с ИГХ продемонстрировало экспрессию специфических клеточных мишеней в В-клеточных лимфомах человека², эмбрионах цыплят³, эмбрионах рыбок данио⁴, сетчатке мыши⁵ и клетках внутреннего уха мыши⁶. В этих исследованиях ткань препарировалась либо с помощью фиксированного формалином парафина (FFPE)^2,3,5, либо свежего целого монтировки ^4,6. В других исследованиях применяли хромогенный РНК-скоп на фиксированных препаратах мозга мышей и крыс ^7,8,9. В частности, Baleriola et al.⁸ описаны два различных тканевых препарата для комбинированного ISH-IHC; фиксированные участки мозга мыши и секции мозга человека FFPE. В недавней публикации мы объединили FISH и флуоресцентный ИГХ на свежезамороженных срезах, чтобы одновременно визуализировать мРНК с низкой распространенностью (рецептор галанина 1, GalR1), мРНК с высокой распространенностью (транспортер глицина 2, GlyT2) и везикулярный транспортер ацетилхолина (vAChT) белка¹⁰ в ретикулярной формации ствола мозга.

Ядро солитарного тракта (НТС) является основной областью мозга, участвующей в вегетативной функции. Расположенная в заднем мозге, эта гетерогенная популяция нейронов получает и интегрирует огромное количество вегетативных сигналов, в том числе и тех, которые регулируют дыхание. NTS содержит несколько нейронных популяций, которые могут быть фенотипически охарактеризованы паттерном экспрессии мишеней мРНК, включая GalR1 и GlyT2, а также белковых маркеров фермента тирозингидроксилазы (TH) и транскрипционного фактора Paired-like homeobox 2b (Phox2b).

Владелец РНКаскопа рекомендует свежезамороженные препараты тканей, но ткани, приготовленные путем транскардиальной перфузионной фиксации цельного животного, наряду с длительной криозащитой (хранение при -20 °C) фиксированных замороженных срезов ткани, распространены во многих лабораториях. Таким образом, мы стремились разработать протоколы для FISH в сочетании с ИГХ с использованием свежезамороженных и фиксированных замороженных тканевых препаратов. Здесь мы приводим свежезамороженные и фиксированные замороженные срезы мозга: (1) протокол комбинированного FISH и флуоресцентного ИГХ, (2) описание качества маркировки мРНК и белков, получаемых при использовании каждого препарата, (3) описание экспрессии GalR1 и GlyT2 в NTS.

Наше исследование показало, что в сочетании с методологией РНК-скопа успех ИГХ варьировался в свежезамороженных и фиксированных замороженных препаратах и зависел от локализации белков-мишеней в клетке. В наших руках мембранно-связанное мечение белков всегда было успешным. В отличие от этого, ВПХ для цитоплазматического белка требовала устранения неполадок даже в тех случаях, когда цитоплазматический белок был чрезмерно экспрессирован у трансгенного животного (Phox2b-GFP)¹¹. Наконец, в то время как GalR1 экспрессируется в некатехоламингических нейронах в NTS, экспрессия GlyT2 отсутствует в NTS.

протокол

Краткое описание этапов предварительной обработки тканей можно найти на рисунке 1. Все процедуры проводились в соответствии с Комитетом по уходу за животными и этике Университета Нового Южного Уэльса в соответствии с руководством по использованию и уходу за животными в научных целях (Австралийский национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям).

1. Пробоподготовка свежезамороженных тканей головного мозга

1. Транскардиальная перфузия
   1. Приготовьте гепаринизированный (2500 Ед/л) 0,1 М фосфатный буфер (ФБ), рН 7,5. Приготовьте суспензию этанола из сухого льда, смешав сухой лед с этанолом. Он будет иметь температуру примерно −72 °C и будет использоваться для немедленного замораживания собранной ткани.
   2. Усыпляют взрослых мышей C57BL/6 и Phox2b-GFP¹¹ (Mouse Genome Informatics Database ID MGI:5776545) путем обезболивания пентобарбиталом натрия (70 мг/кг, в/в) с помощью 27,5-дюймового игольчатого калибра.
      ВНИМАНИЕ: Пентобарбитал является барбитуратом. Он остро токсичен в высоких дозах и может вызвать смерть от остановки дыхания. Перед использованием ознакомьтесь с местными рекомендациями по здравоохранению, правовым нормам и правилам безопасности материалов.
   3. Обнажите сердце и канюлируйте левый желудочек с помощью иглы (23-дюймового калибра). Проводят транскардиальную перфузию гепаринизированным 0,1 М ПБ до очищения крови (2-3 минуты) со скоростью потока 11-13 мл/мин. Определяют очищение крови, контролируя окраску печени и эффузат из правого предсердия¹².
   4. Изолируйте мозг от полости черепа, немедленно поместите его в компаунд с оптимальной температурой резки (OCT) в криомолд или алюминиевую фольгу и поместите в ванну с этанолом с сухим льдом. Храните замороженную встроенную ткань в герметичном контейнере при температуре -80 °C до 3 месяцев.
2. Секционирование свежезамороженных тканей
   1. Установите температуру криостата на -20 °C. Оставьте ткань, внедренную в ОКТ, и криостатный патрон в криостате на ~30 минут, чтобы обеспечить равновесие к новой температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите ткань в замороженном виде; транспортируйте ткань из морозильной камеры с температурой -80 °C в криостат на сухом льду.
   2. Закрепите ткань на предварительно охлажденном патроне криостата с помощью ОКТ-компаунда. В этом протоколе тканевые блоки устанавливались на патрон в корональной плоскости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите излишки ОКТ с ткани с помощью бритвенного лезвия, чтобы свести к минимуму количество ОКТ, срезаемого криостатом и впоследствии переносимого на предметное стекло.
   3. Вырежьте корональные срезы толщиной 14 мкм и установите их на предметные стекла для микроскопии.
      1. Перед монтажом секций нагрейте слайды до комнатной температуры. После того, как секция будет смонтирована, храните салазки в слайд-боксе в криостате.
      2. Если на одном предметном стекле необходимо установить более одной секции, согрейте область для второй секции, положив палец на противоположную сторону предметного стекла на 5-10 секунд, чтобы облегчить прилегание секции к предметному стеклу. Срез холодной ткани не будет прикреплен к холодному предметному стеклу. Секции должны прилегать к слайдам ровно; Складывание приведет к тому, что они упадут с направляющих во время стирки.
      3. Если на участках замечены трещины, увеличьте температуру криостата на 1-5 °C, чтобы этого избежать. Особенно важно расположить срезы тканей в непосредственной близости друг от друга на одном предметном стекле. Это предотвратит потерю FISH-зондов и реагентов во время анализа.
   4. Срезы тканей, прикрепленные к предметным стеклам, храните в герметичном контейнере при температуре -80 °C до 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите секции замороженными и избегайте циклов замораживания, чтобы предотвратить деградацию РНК. Транспортируйте слайд-бокс из криостата в морозильную камеру с температурой -80 °C на сухом льду.
3. Фиксация свежезамороженных тканей
   1. В день проведения зондового анализа FISH приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в 0,1 M PB, pH 7,5 (4% раствор PFA). Фильтруют, пропуская фильтровальную бумагу (класс 1: 11 мкм, таблица материалов) в воронку Бюхнера или тигельный фильтр.
      ВНИМАНИЕ: PFA вреден и токсичен при контакте с кожей или вдыхании. Все процедуры с раствором PFA следует проводить в вытяжном шкафу. Отходы раствора PFA следует утилизировать тщательно в соответствии с институциональными протоколами безопасности.
   2. Охладите 4% раствор PFA до 4 °C. Транспортируйте задвиженную ткань из морозильной камеры с температурой -80 °C в сухом льду и сразу же погрузите ее в предварительно охлажденный фиксатор на 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы этот этап фиксации не превышал 15 минут, так как чрезмерная фиксация приведет к неспецифической фоновой маркировке.
4. Обезвоживание свежезамороженных тканей
   1. Обезвоживайте срезы тканей, погружая предметные стекла в дифференцированные концентрации этанола. В банку Coplin сначала погрузите 50%, затем 70% и, наконец, абсолютный этанол на 5 минут каждый при комнатной температуре. Повторите окончательную абсолютную инкубацию этанола во второй раз.
   2. Высушите горки на воздухе и очертите группу секций с помощью гидрофобной барьерной ручки, убедившись, что внутренняя площадь сведена к минимуму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что предметное стекло полностью высохло, прежде чем рисовать гидрофобный барьер. Гидрофобный барьер должен окружать участки ткани полностью без зазоров и должен быть сухим перед дальнейшей обработкой.

2. Пробоподготовка фиксированной замороженной ткани головного мозга

1. Фиксация транскардиальной перфузии
   1. Эвтаназию мышей обезболивали пентобарбиталом натрия (70 мг/кг, в/м) с последующей транскардиальной перфузией, сначала 0,1 М ПБ, затем 4% раствором ПФА. Закрепите 10-минутной перфузией со скоростью 11-13 мл/мин.
   2. Изолируют мозг от полости черепа после перфузионной фиксации и погружают на ночь в 4% раствор PFA при температуре 4 °C.
2. Срезы фиксированных тканей
   1. Промыть мозг в стерильном 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) перед удалением менингеальных слоев с помощью препарирующего микроскопа с помощью тонких щипцов.
   2. Разрежьте мозг точно на блоки (отделите ствол мозга от переднего мозга перед разделением вибратомы) с помощью матрицы мозга (таблица материалов). В частности, разрежьте ствол мозга каудально в месте пирамидной декуссации и рассеките мозжечок. Точно так же разрезают передний мозг непосредственно рострально к зрительной хиазме.
   3. Закрепите ткань на вибрирующем патроне микротома с помощью цианоакрилата и поместите в 2% раствор агара.
   4. Срезы тканей толщиной 30 мкм вырезать с помощью вибрирующего микротома и хранить срезы в растворе криопротектора (30% безРНКазная сахароза, 30% этиленгликоль, 1% поливинилпирролидон (ПВП-40), в 0,1 М ПБ, рН 7,4). Срезы тканей можно хранить в криопротекторе при температуре -20 °C до 6 месяцев.
3. Подготовка фиксированных секций перед FISH
   1. В день FISH промойте свободно плавающие участки три раза, по 10 минут на каждую стирку, чтобы удалить раствор криопротектора. Для промывки помещают срезы в 0,1 м PBS в 12-луночную планшет для культивирования клеток и перемешивают на вращающемся платформенном шейкере (90 - 100 об/мин).
   2. После мытья используйте кисть, чтобы закрепить срезы на предметных стеклах для микроскопии и высушить на воздухе не менее 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Секции должны плотно прилегать к направляющим, так как любые выраженные складки приведут к их отсоединению во время стирки.
   3. Используя гидрофобную барьерную ручку, нарисуйте барьер вокруг секций, чтобы ограничить реагенты FISH секциями. Опять же, важно свести к минимуму внутреннюю площадь контура, нарисованного барьерной ручкой.
      ВОЗМОЖНАЯ ТОЧКА РАЗРЫВА: Срезы можно хранить при комнатной температуре в течение ночи, чтобы продолжить анализ на следующий день.

3. Анализ РЫБЫ

ПРИМЕЧАНИЕ: Остальная часть протокола относится как к свежезамороженным, так и к фиксированным замороженным тканям.

1. Подготовьте реагенты и инструменты для этапов гибридизации и амплификации.
   1. Установите настольный инкубатор и водяную баню на 40 °C.
   2. Подготовьте увлажненную, защищенную от света камеру для инкубации предметных стекол. Увлажнение предотвращает пересыхание тканей – предметные стекла надежно расположены над влажным резервуаром. В идеале камера изготовлена из сверхпрочного полистирола, она светонепроницаема и воздухонепроницаема для поддержания насыщенной атмосферы водяного пара. Закрытие камеры основано на минимальном трении, чтобы избежать движения. Мы использовали слайд-бокс, выстланный влажными лабораторными салфетками (Таблица материалов) внизу. Поместите слайд-бокс внутрь инкубатора, чтобы он прогрелся до 40 °C.
   3. Нагрейте буфер для промывки 50x (таблица материалов) и зонды до 40 °C в течение 10 минут на водяной бане, затем остудите до комнатной температуры.
   4. Приготовьте 1 л 1x Wash Buffer из 50-кратной концентрации бульона.
   5. Подготовка смеси зондов (Таблица материалов): зонд C1 готов к использованию при концентрации на складе, в то время как зонды C2 и C3 поставляются с концентрацией 50x и требуют разбавления разбавителем, входящим в комплект.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси зондов можно хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
2. Лечение протеазой
   1. Инкубируйте срезы с Protease III (таблица материалов) при комнатной температуре в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что протеаза III и инкубационные реагенты в последующих процессах (смесь зондов, растворы для амплификации, блокирующий буфер и сыворотки антител) полностью покрывают участки. Наконечник пипетки можно использовать для распределения реагента по участку, чтобы покрыть всю площадь внутри гидрофобного барьера.
   2. Дважды промойте предметные стекла 0,1 м PBS, каждый раз по 2 минуты, в большой пластиковой квадратной чашке Петри. Здесь использовалась квадратная чашка для биопроб размером 245 мм х 245 мм (Таблица материалов). Возьмите с одной стороны блюда и осторожно наклоните 3-5 раз. После промывки смахните излишки 0,1 М PBS с предметного стекла и сразу же добавьте следующий реагент. Не допускайте высыхания срезов ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время каждой стирки предметные стекла погружаются в раствор комнатной температуры. Это рабочий процесс для всех последующих этапов стирки. Фиксированные секции толщиной 30 мкм легче смещаются с предметных стекол, чем секции толщиной 14 мкм, будьте осторожны во время стирки.
3. Гибридизация и амплификация
   1. Смыв раствор протеазы, поместите предметные стекла в увлажненную, предварительно прогретую камеру. Инкубируйте срезы с зондовой смесью (таблица материалов) в течение 2 часов при температуре 40 °C в настольном инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что для положительных и отрицательных контрольных зондов отведено не менее 2 секций для оценки качества образца РНК и оптимальной пермеабилизации. Положительные контрольные зонды нацелены на гены, отвечающие за ведение домашнего хозяйства; В данном случае это был коктейль из РНК, нацеленных на убиквитин С (UBC; высокая распространенность), пептидилпропилизомеразу B (PPIB; умеренное распространение) и РНК-полимеразу 2a (POLR2A; низкое распространение). Отрицательные контрольные зонды нацелены на бактериальный ген 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатредуктазы (DapB), который обычно отсутствует в образцах мозга мышей. Положительный сигнал DapB указывает на неспецифический сигнал и/или бактериальное загрязнение образца.
   2. После гибридизации с зондовой смесью этапы усиления сигнала состоят из инкубации с усилителем 1-FL (30 минут), затем с усилителем 2-FL (15 минут), затем с усилителем 3-FL (30 минут) и, наконец, с усилителем 4-FL (15 минут) - каждый при 40 °C. С помощью прилагаемых флаконов-капельниц покройте участки тканей раствором для амплификации. Приступайте к анализу ИГХ после последнего этапа амплификации.
   3. Промывайте предметные стекла буфером для промывки дважды в течение 2 минут между гибридизацией зонда и каждым этапом амплификации.

4. Анализ ИГХ

1. Шаг блокировки IHC
   1. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител, инкубируют срезы в течение 1 ч при комнатной температуре с блокирующим раствором, содержащим 10% нормальной лошадиной сыворотки, 0,3% Tween20 в 1x TBSm (50 мМ Tris-Cl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,05% мертиолят) после анализа FISH. Готовят первичные антитела в буфере для разведения, содержащем 1x TBSm, 5% нормальной лошадиной сыворотки и 0,1% Tween20. Основные поставщики антител перечислены в Таблице материалов.
2. Иммуногистохимия
   1. Удалите излишки блокирующего буфера, щелкнув предметным стеклом, и инкубируйте срезы с первичными антителами в течение ночи при 4 °C.
   2. Промойте предметные стекла 3 раза (по 5 минут каждый) с 1 TBSm и инкубируйте со вторичными антителами в разбавителе, содержащем 1x TBSm, 1% нормальной лошадиной сыворотки и 0,1% Tween20 в течение 2 часов при комнатной температуре. Вторичные антитела, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.
   3. Промойте предметные стекла 3 раза с помощью 1x TBSm (5 минут каждая) перед нанесением покрытия монтажным средством с DAPI (таблица материалов) или без него.

5. Визуализация

1. Исследуйте иммуноокрашивание под эпифлуоресцентным микроскопом, оснащенным камерой (подробности см. в таблице материалов ). Получайте репрезентативные изображения с 20-кратным увеличением и сохраняйте их в виде файлов TIFF.
2. Экспортируйте репрезентативные изображения в программное обеспечение для обработки изображений (таблица материалов) для регулировки яркости/контрастности для повышения четкости и отражения истинного рендеринга.

6. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Количественный анализ целевых транскриптов

ПРИМЕЧАНИЕ: Это статья о методах, и количественные результаты не предоставляются. Метод количественной оценки, представленный здесь, взят из Dereli et al.¹⁰. См.

1. Получите изображения из областей интереса, как описано в 5.1, и примените одни и те же настройки микроскопа и камеры (например, время экспозиции и интенсивность света) ко всем изображениям одного и того же флуорофора.
2. Постройте график профилей нейронов с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Таблица материалов).
3. Выровняйте срезы по уровню Брегмы в соответствии со стереотаксическим атласом мозга¹³.
4. Примените одинаковую яркость и контрастность ко всем изображениям одного и того же флуорофора. Рассматривайте только нейроны с DAPI-окрашенными ядрами.
5. Вручную подсчитайте количество мРНК, экспрессирующих белки, мРНК/мРНК, белок/белок и коэкспрессирующих мРНК/белок клеток в интересующей области.
6. Чтобы уменьшить систематическую ошибку в экспериментальных результатах, сделайте так, чтобы человек, оценивающий результаты эксперимента, был слеп к экспериментальным группам.
7. Примените поправку Аберкромби¹⁴ к общему количеству ячеек с помощью следующего уравнения Аберкомби:
   Скорректированное количество ячеек = ручное количество ячеек x толщина сечения / (толщина сечения + размер ядра)
   Например, для срезов толщиной 14 мкм средняя ширина ядра составляет 7,7 ± 0,3 мкм, а средняя толщина сечения составляет 14 ± 1 мкм из расчета 30 клеток и 10 секций соответственно у 5^{животных10}. Согласно уравнению Аберкромби, скорректированное количество клеток будет ручным подсчетом клеток x 14/(14+7,7).

Рисунок 1: Параллельный рабочий процесс этапов предварительной обработки тканей как для свежезамороженных, так и для параформальдегидных фиксированных тканей. Этапы обработки свежезамороженных тканей отображаются в красных рамках, в то время как этапы обработки фиксированных тканей из параформальдегида (PFA) отображаются в синих рамках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Краткое описание комбинированной процедуры FISH-зонда и иммуногистохимии. После предварительной обработки ткани ткань, установленную на предметном стекле, обматывают с помощью гидрофобного барьерного пера, как показано на первом кадре, и инкубируют в растворе протеазы при комнатной температуре. После промывки ткань переносят в настольный инкубатор для гибридизации на 2 часа перед последовательными этапами амплификации. В системе гибридизации in situ используется запатентованная конструкция Z-зонда, предусилители и усилители, как показано на кадрах 3-6⁶. После того, как ткань прошла обработку FISH-зондом, ее промывают перед блокировкой обычной лошадиной сывороткой. Первичную инкубацию антител проводят в течение ночи при 4 °C для максимального связывания антитело-антиген. Инкубацию вторичных антител (2 часа) проводили при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

В данной работе мы описываем метод комбинирования мультиплексного FISH с флуоресцентным ИГХ для локализации экспрессии мРНК для GalR1 и GlyT2 с использованием свежезамороженных и параформальдегидных фиксированных тканей соответственно в NTS мыши. Конвейер процедур обработки тканей, FISH и IHC, ?...

Обсуждение

В нейронауках FISH и IHC обычно используются для исследования пространственной организации и функциональной значимости мРНК или белков в субпопуляциях нейронов. Протокол, описанный в этом исследовании, повышает способность к одновременному обнаружению мРНК и белков в отделах мозга. Наш ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
C57BL/6 mouse	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
Phox2b-eGFP mouse	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
REAGENTS
Cyanoacrylate	Loctite
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Heparin-Sodium	Clifford Hallam Healthcare	1070760	Consult local veterinary supplier or pharmacy.
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd	N/A	Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol
Molecular grade agarose powder	Sigma Aldrich	5077
OCT Compound, 118mL	Scigen Ltd	4586
Paraformaldehyde, prilled, 95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000  (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930	With or without DAPI
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability)	Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)	ADV320850	Includes 50x Wash buffer and Protease III
RNase Away	Thermo-Fisher Scientific	7003
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20, for molecular biology	Sigma-Aldrich	P9416
EQUIPMENT
Benchtop incubator	Thermoline scientific micro incubator	Model: TEI-13G
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm	Ted Pella	15050
Cryostat	Leica	CM1950
Drawing-up needle (23 inch gauge)	BD	0288U07
Hydrophobic Barrier Pen	Vector labs	H-4000
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes	Kimberley Clark Professional	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
Peristaltic pump	Coleparmer Masterflex	L/S Series
Retiga 2000R Digital Camera	QImaging	RET-2000R-F-CLR	colour camera
SuperFrost Plus Glass Slides (White)	Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
Vibrating Microtome (Vibratome)	Leica	VT1200S
Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter	Merck	WHA1001110
SOFTWARES
CorelDRAW	Corel Corporation	Version 7
FIJI (ImageJ Distribution)	Open Source/GNU General Public Licence (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z   and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
PRIMARY ANTIBODIES
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	Millipore Sigma	AB1542	Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1	Millipore Sigma	MAB318	Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody	Sigma-Aldrich	ABN100	Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394
GFP Antibody	Novus Biologicals	NB600-308	Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058
Phox2b Antibody (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765
SECONDARY ANTIBODIES
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	705-175-147	Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-175-147	Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe	ACDBio	448821-C1	targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe	ACDBio	409741-C3	targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)
Phox2b oligonucleotide probe	ACDBio	407861-C2	targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)