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이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.
형광 in situ hybridization(FISH)은 세포 내 특정 RNA 전사체의 존재 및 공간 분포를 식별하는 분자 기술입니다. 기능적으로 식별된 뉴런의 신경화학적 표현형은 일반적으로 면역조직화학(IHC)을 사용하는 여러 항체(표적 단백질)와의 동시 표지와 현장 교잡(표적 RNA)의 최적화를 동시에 필요로 합니다. 특정 뉴런을 특성화하기 위한 "신경화학적 서명"을 달성할 수 있지만 복잡한 요인에는 방법을 결합하기 전에 FISH 및 IHC 표적을 확인해야 할 필요성과 동일한 조직 섹션 내에서 동시에 표적화될 수 있는 제한된 수의 RNA 및 단백질이 포함됩니다.
여기서는 RNAscope FISH와 형광 면역염색을 각각 사용하여 동일한 뇌 절편에서 여러 mRNA와 단백질을 검출하는 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 제제를 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 면역조직화학적으로 확인된 뇌간 핵에서 저농도 mRNA(예: 갈라닌 수용체 1)와 고농도 mRNA(예: 글리신 수송체 2)의 발현 패턴을 설명하기 위해 결합된 방법을 사용합니다.
FISH 분석의 다운스트림 단백질 라벨링에 대한 주요 고려 사항은 조직 준비 및 FISH 프로브 라벨링의 최적화를 넘어섭니다. 예를 들어, 항체 결합 및 표지 특이성은 FISH 프로브 분석 내에서 단백질 분해 효소 단계에 의해 해로운 영향을 받을 수 있음을 발견했습니다. 프로테아제는 펩타이드 결합의 가수분해 절단을 촉진하여 FISH 프로브가 세포에 쉽게 진입할 수 있도록 하지만, 후속 IHC 분석에서 표적이 되는 단백질을 분해하여 표적 결합을 생성할 수도 있습니다. 표적 단백질의 세포 내 위치는 FISH 프로브 분석 후 IHC 성공에 기여하는 또 다른 요소입니다. 표적 단백질이 막 결합되어 있을 때 IHC 특이성이 유지되는 것을 관찰한 반면, IHC 표적 세포질 단백질은 광범위한 문제 해결이 필요했습니다. 마지막으로, 슬라이드 장착형 고정 냉동 조직의 취급이 신선 냉동 조직보다 더 어렵다는 것을 발견했지만, RNAscope와 결합했을 때 IHC 품질은 고정 냉동 조직에서 전반적으로 더 좋았습니다.
신경화학적으로 뉴런의 하위 집단을 정의하는 단백질과 mRNA는 일반적으로 각각 면역조직화학(IHC) 및/또는 제자리 교잡(ISH)의 조합으로 식별됩니다. ISH와 IHC 기법을 결합하면 다중 라벨링 용량을 극대화하여 기능적 뉴런(신경화학적 코딩)에 고유한 공동 국소화 패턴의 특성화를 용이하게 할 수 있습니다.
RNAscope를 포함한 형광 ISH(FISH) 분석법은 방사성 ISH 및 비방사성 발색 ISH와 같은 이전 RNA 검출 방법에 비해 감도와 특이도가 더 높습니다. FISH는 단일 mRNA 전사체를 반점 염색 지점으로 시각화할 수 있습니다1. 또한 RNAscope 분석을 통해 다양한 형광단 태그를 사용하여 한 번에 더 많은 수의 RNA 표적을 라벨링할 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구하고 기술적 한계는 단일 실험에서 사용할 수 있는 형광단/염색체의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에는 현미경 필터 세트의 가용성이 포함됩니다. 이러한 고려 사항은 신경화학적 식별이 FISH와 IHC를 결합한 것을 사용할 때 각 기술을 개별적으로 사용하는 것과 비교할 때 복잡해지는데, 이는 한 방법에 최적화된 고유한 단계가 다른 방법에 해로울 수 있기 때문입니다.
IHC와 결합된 FISH의 이전 적용은 인간 B세포 림프종2, 병아리 배아3, 제브라피시 배아4, 마우스 망막5 및 마우스 내이 세포6에서 특정 세포 표적의 발현을 입증했다. 이 연구에서 조직 준비는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE)2,3,5 또는 신선한 전체 마운트 4,6이었습니다. 다른 연구에서는 고정 마우스 및 쥐 뇌 제제에 발색 RNAscope를 적용했습니다 7,8,9. 특히, Baleriola et al.도 8은 ISH-IHC 병용을 위한 두 가지 상이한 조직 제제를 설명하였다; 고정 마우스 뇌 절편 및 FFPE 인간 뇌 절편. 최근 간행물에서 우리는 신선 냉동 절편에 FISH와 형광 IHC를 결합하여 뇌간 망상 형성에서 저농도 mRNA(갈라닌 수용체 1, GalR1), 고농도 mRNA(글리신 수송체 2, GlyT2) 및 소포성 아세틸콜린 수송체(vAChT) 단백질10을 동시에 시각화했습니다.
고독관의 핵(NTS)은 자율 신경 기능에 관여하는 주요 뇌 영역입니다. 후뇌에 위치한 이 이질적인 뉴런 집단은 호흡을 조절하는 신호를 포함하여 방대한 수의 자율 신경 신호를 수신하고 통합합니다. NTS는 여러 신경 세포 집단을 보유하고 있으며, 이는 GalR1 및 GlyT2를 포함한 mRNA 표적의 발현 패턴과 효소 티로신 하이드록실라제(TH) 및 전사 인자 쌍 유사 호메오박스 2b(Phox2b)에 대한 단백질 마커에 의해 표현형적으로 특징지어질 수 있습니다.
RNAscope 소유자는 신선한 냉동 조직 준비를 권장하지만 고정 냉동 조직 절편의 장기 냉동 보호(-20°C에서 보관)와 함께 전체 동물 심내 관류 고정으로 준비된 조직은 많은 실험실에서 일반적입니다. 따라서 우리는 신선 냉동 및 고정 냉동 조직 제제를 사용하여 IHC와 함께 FISH에 대한 프로토콜을 수립하고자 했습니다. 여기에서는 신선 냉동 및 고정 냉동 뇌 절편을 제공합니다: (1) FISH 및 형광 IHC의 결합을 위한 프로토콜 (2) 각 제제를 사용할 때 생산된 mRNA 및 단백질 라벨링의 품질에 대한 설명 (3) NTS에서 GalR1 및 GlyT2의 발현에 대한 설명.
우리의 연구는 RNAscope 방법론과 결합했을 때 IHC의 성공은 신선 냉동 및 고정 냉동 제제에서 다양했으며 세포 내 표적 단백질의 국소화에 따라 달라진다는 것을 밝혔습니다. 우리 손에서는 멤브레인 결합 단백질 라벨링이 항상 성공적이었습니다. 대조적으로, 세포질 단백질에 대한 IHC는 형질전환 동물(Phox2b-GFP)에서 세포질 단백질이 과발현된 경우에도 문제 해결이 필요했습니다(Phox2b-GFP)11. 마지막으로, GalR1은 NTS에서 비-카테콜아민성 뉴런에서 발현되는 반면, GlyT2 발현은 NTS에서 존재하지 않는다.
조직 전처리 단계의 요약은 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 모든 절차는 과학적 목적을 위한 동물의 사용 및 관리에 대한 지침(호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회)에 따라 뉴사우스웨일즈 대학교의 동물 관리 및 윤리 위원회에 따라 수행되었습니다.
1. 신선 냉동 뇌 조직의 샘플 준비
2. 고정된 동결 뇌 조직의 샘플 준비
3. 물고기 분석
참고: 프로토콜의 나머지 부분은 신선 냉동 조직과 고정 냉동 조직 모두에 적용됩니다.
4. IHC 분석
5. 이미징
6. 선택 사항: 표적 전사체의 정량 분석
참고: 이 기사는 방법 문서이며 정량적 결과는 제공되지 않습니다. 여기에 제시된 정량화 방법은 Dereli et al.에서 가져온 것입니다.10.
그림 1: 신선 냉동 조직과 파라포름알데히드 고정 조직 모두에 대한 조직 전처리 단계의 병렬 워크플로우. 신선 냉동 조직의 처리 단계는 빨간색 윤곽선이 있는 상자에 표시되는 반면, 파라포름알데히드(PFA) 고정 조직의 처리 단계는 파란색 윤곽선이 있는 상자에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 결합된 FISH 프로브와 면역조직화학 절차의 요약. 조직 전처리 후, 첫 번째 프레임에서 볼 수 있듯이 슬라이드 장착 조직을 소수성 배리어 펜을 사용하여 둘러싸고 실온에서 프로테아제 용액에서 배양합니다. 세척 후, 조직을 순차적 증폭 단계 전에 2시간 동안 하이브리드화를 위해 벤치탑 인큐베이터로 옮깁니다. in situ hybridization 시스템은 프레임 3-66에서 볼 수 있듯이 독점적인 'Z 프로브' 설계, 프리앰프 및 앰프를 활용합니다. 조직이 FISH 프로브 처리를 거치면 일반 말 혈청으로 차단하기 전에 세척합니다. 1차 항체 배양은 항체-항원 결합을 최대화하기 위해 4°C에서 밤새 수행됩니다. 2차 항체 배양(2시간)은 실온에서 실시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기에서는 마우스 NTS에서 각각 신선 냉동 및 파라포름알데히드 고정 조직을 사용하여 GalR1 및 GlyT2에 대한 mRNA 발현을 국소화하기 위해 멀티플렉스 FISH와 형광 IHC를 결합하는 방법을 간략하게 설명합니다. 분석법에 설명된 조직 처리, FISH 및 IHC 절차의 파이프라인은 그림 1 및 그림 2에 표시되어 있습니다. 표 1 은 각 그림에 사용된 FISH 프로?...
신경 과학에서 FISH와 IHC는 신경 하위 집단 내에서 mRNA 또는 단백질의 공간 조직 및 기능적 중요성을 조사하는 데 일상적으로 사용됩니다. 이 연구에서 설명된 프로토콜은 뇌 절편에서 mRNA와 단백질을 동시에 검출할 수 있는 능력을 향상시킵니다. 당사의 결합된 다중 FISH-IHC 분석은 신선 냉동 및 고정 뇌 제제 모두에서 NTS의 뚜렷한 신경 하위 집단의 표현형 식별을 가능하게 했습니다. 고정 냉동 조?...
이 연구는 호주 연구 위원회 디스커버리 프로젝트 보조금 DP180101890와 Rebecca L Cooper Medical Research Foundation 프로젝트 보조금 PG2018110
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ANIMALS | |||
C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
REAGENTS | |||
Cyanoacrylate | Loctite | ||
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
EQUIPMENT | |||
Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
SOFTWARES | |||
CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
PRIMARY ANTIBODIES | |||
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
SECONDARY ANTIBODIES | |||
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
RNASCOPE PROBES | |||
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
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