Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

요약

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

초록

형광 in situ hybridization(FISH)은 세포 내 특정 RNA 전사체의 존재 및 공간 분포를 식별하는 분자 기술입니다. 기능적으로 식별된 뉴런의 신경화학적 표현형은 일반적으로 면역조직화학(IHC)을 사용하는 여러 항체(표적 단백질)와의 동시 표지와 현장 교잡(표적 RNA)의 최적화를 동시에 필요로 합니다. 특정 뉴런을 특성화하기 위한 "신경화학적 서명"을 달성할 수 있지만 복잡한 요인에는 방법을 결합하기 전에 FISH 및 IHC 표적을 확인해야 할 필요성과 동일한 조직 섹션 내에서 동시에 표적화될 수 있는 제한된 수의 RNA 및 단백질이 포함됩니다.

여기서는 RNAscope FISH와 형광 면역염색을 각각 사용하여 동일한 뇌 절편에서 여러 mRNA와 단백질을 검출하는 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 제제를 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 면역조직화학적으로 확인된 뇌간 핵에서 저농도 mRNA(예: 갈라닌 수용체 1)와 고농도 mRNA(예: 글리신 수송체 2)의 발현 패턴을 설명하기 위해 결합된 방법을 사용합니다.

FISH 분석의 다운스트림 단백질 라벨링에 대한 주요 고려 사항은 조직 준비 및 FISH 프로브 라벨링의 최적화를 넘어섭니다. 예를 들어, 항체 결합 및 표지 특이성은 FISH 프로브 분석 내에서 단백질 분해 효소 단계에 의해 해로운 영향을 받을 수 있음을 발견했습니다. 프로테아제는 펩타이드 결합의 가수분해 절단을 촉진하여 FISH 프로브가 세포에 쉽게 진입할 수 있도록 하지만, 후속 IHC 분석에서 표적이 되는 단백질을 분해하여 표적 결합을 생성할 수도 있습니다. 표적 단백질의 세포 내 위치는 FISH 프로브 분석 후 IHC 성공에 기여하는 또 다른 요소입니다. 표적 단백질이 막 결합되어 있을 때 IHC 특이성이 유지되는 것을 관찰한 반면, IHC 표적 세포질 단백질은 광범위한 문제 해결이 필요했습니다. 마지막으로, 슬라이드 장착형 고정 냉동 조직의 취급이 신선 냉동 조직보다 더 어렵다는 것을 발견했지만, RNAscope와 결합했을 때 IHC 품질은 고정 냉동 조직에서 전반적으로 더 좋았습니다.

서문

신경화학적으로 뉴런의 하위 집단을 정의하는 단백질과 mRNA는 일반적으로 각각 면역조직화학(IHC) 및/또는 제자리 교잡(ISH)의 조합으로 식별됩니다. ISH와 IHC 기법을 결합하면 다중 라벨링 용량을 극대화하여 기능적 뉴런(신경화학적 코딩)에 고유한 공동 국소화 패턴의 특성화를 용이하게 할 수 있습니다.

RNAscope를 포함한 형광 ISH(FISH) 분석법은 방사성 ISH 및 비방사성 발색 ISH와 같은 이전 RNA 검출 방법에 비해 감도와 특이도가 더 높습니다. FISH는 단일 mRNA 전사체를 반점 염색 지점으로 시각화할 수 있습니다¹. 또한 RNAscope 분석을 통해 다양한 형광단 태그를 사용하여 한 번에 더 많은 수의 RNA 표적을 라벨링할 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구하고 기술적 한계는 단일 실험에서 사용할 수 있는 형광단/염색체의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에는 현미경 필터 세트의 가용성이 포함됩니다. 이러한 고려 사항은 신경화학적 식별이 FISH와 IHC를 결합한 것을 사용할 때 각 기술을 개별적으로 사용하는 것과 비교할 때 복잡해지는데, 이는 한 방법에 최적화된 고유한 단계가 다른 방법에 해로울 수 있기 때문입니다.

프로토콜

조직 전처리 단계의 요약은 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 모든 절차는 과학적 목적을 위한 동물의 사용 및 관리에 대한 지침(호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회)에 따라 뉴사우스웨일즈 대학교의 동물 관리 및 윤리 위원회에 따라 수행되었습니다.

1. 신선 냉동 뇌 조직의 샘플 준비

1. 심 관류
   1. 헤파린화 (2500 U / L) 0.1M 인산염 완충액 (PB), pH 7.5를 준비합니다. 드라이 아이스와 에탄올을 혼합하여 드라이 아이스 에탄올 슬러리를 만듭니다. 이것은 약 -72 °C의 온도를 가지며 수확된 조직의 즉각적인 동결에 사용됩니다.
   2. 27.5인치 바늘 게이지를 사용하여 펜토바르비탈나트륨(70mg/kg, ip)으로 마취하여 성체 C57BL/6 및 Phox2b-GFP¹¹(Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) 마우스를 안락사시킵니다.
      주의: 펜토바르비탈은 바르비투르산염입니다. 과다 복용 시 급성 독성이 있으며 호흡 정지로 사망할 수 있습니다. 사용하기 전에 현지 의료, 법률 및 물질 안전 지침을 참조하십시오.
   3. 심장을 노출시키고....

결과

여기에서는 마우스 NTS에서 각각 신선 냉동 및 파라포름알데히드 고정 조직을 사용하여 GalR1 및 GlyT2에 대한 mRNA 발현을 국소화하기 위해 멀티플렉스 FISH와 형광 IHC를 결합하는 방법을 간략하게 설명합니다. 분석법에 설명된 조직 처리, FISH 및 IHC 절차의 파이프라인은 그림 1 및 그림 2에 표시되어 있습니다. 표 1 은 각 그림에 사용된 FISH 프로?.......

토론

신경 과학에서 FISH와 IHC는 신경 하위 집단 내에서 mRNA 또는 단백질의 공간 조직 및 기능적 중요성을 조사하는 데 일상적으로 사용됩니다. 이 연구에서 설명된 프로토콜은 뇌 절편에서 mRNA와 단백질을 동시에 검출할 수 있는 능력을 향상시킵니다. 당사의 결합된 다중 FISH-IHC 분석은 신선 냉동 및 고정 뇌 제제 모두에서 NTS의 뚜렷한 신경 하위 집단의 표현형 식별을 가능하게 했습니다. 고정 냉동 조?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
C57BL/6 mouse	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
Phox2b-eGFP mouse	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
REAGENTS
Cyanoacrylate	Loctite
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Heparin-Sodium	Clifford Hallam Healthcare	1070760	Consult local veterinary supplier or pharmacy.
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd	N/A	Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol
Molecular grade agarose powder	Sigma Aldrich	5077
OCT Compound, 118mL	Scigen Ltd	4586
Paraformaldehyde, prilled, 95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000  (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930	With or without DAPI
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability)	Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)	ADV320850	Includes 50x Wash buffer and Protease III
RNase Away	Thermo-Fisher Scientific	7003
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20, for molecular biology	Sigma-Aldrich	P9416
EQUIPMENT
Benchtop incubator	Thermoline scientific micro incubator	Model: TEI-13G
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm	Ted Pella	15050
Cryostat	Leica	CM1950
Drawing-up needle (23 inch gauge)	BD	0288U07
Hydrophobic Barrier Pen	Vector labs	H-4000
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes	Kimberley Clark Professional	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
Peristaltic pump	Coleparmer Masterflex	L/S Series
Retiga 2000R Digital Camera	QImaging	RET-2000R-F-CLR	colour camera
SuperFrost Plus Glass Slides (White)	Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
Vibrating Microtome (Vibratome)	Leica	VT1200S
Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter	Merck	WHA1001110
SOFTWARES
CorelDRAW	Corel Corporation	Version 7
FIJI (ImageJ Distribution)	Open Source/GNU General Public Licence (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z   and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
PRIMARY ANTIBODIES
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	Millipore Sigma	AB1542	Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1	Millipore Sigma	MAB318	Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody	Sigma-Aldrich	ABN100	Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394
GFP Antibody	Novus Biologicals	NB600-308	Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058
Phox2b Antibody (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765
SECONDARY ANTIBODIES
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	705-175-147	Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-175-147	Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe	ACDBio	448821-C1	targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe	ACDBio	409741-C3	targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)
Phox2b oligonucleotide probe	ACDBio	407861-C2	targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)