Стандартизация цитометрического анализа на основе антител к яичному желтку

Резюме

В данном протоколе описана методика подготовки латексных шариков для анализов с использованием антител IgY для выявления антигена.

Аннотация

Иммунологические анализы являются важными тестами для обнаружения многочисленных молекулярных мишеней. Среди методов, доступных в настоящее время, цитометрический анализ шариков приобрел известность в последние десятилетия. Каждая микросфера, считываемая оборудованием, представляет собой событие анализа способности к взаимодействию между испытуемыми молекулами. Тысячи этих событий считываются в одном анализе, что обеспечивает высокую точность и воспроизводимость анализа. Эта методология также может быть использована для валидации новых входных данных, таких как антитела IgY, для диагностики заболеваний. Эти антитела получают путем иммунизации цыплят интересующим антигеном и последующего извлечения иммуноглобулина из желтка яиц животных; Таким образом, это безболезненный и высокопродуктивный метод получения антител. В дополнение к методологии высокоточной валидации способности к распознаванию антител в этом анализе, в данной работе также представлен метод извлечения этих антител, определения наилучших условий сопряжения антител и латексных шариков, а также определения чувствительности теста.

Введение

Среди методов иммунологического анализа, направленных на диагностику заболеваний, цитометрический анализ шариков стал высокочувствительным и надежным подходом, поскольку он позволяет анализировать тысячи частиц в одном анализе1^. Этот метод, помимо высокой производительности и возможности использования меньших объемов образцов, также обладает большой гибкостью, поскольку позволяет обнаруживать несколько молекул, таких как цитокины, молекулы адгезии, изотипы антител и белки ^2,3.

Для разработки этих анализов используются различные частицы, в том числе латексные шарики, которые являются эффективным и недорогим сырьем. Они могут представлять модификации на своей поверхности, такие как наличие функциональных групп или белков, которые допускают ковалентное или нековалентное соединение определенных молекул ^3,4,5.

Эти иммунологические анализы используют такие компоненты, как антигены и антитела, для обнаружения маркеров заболеваний и обычно требуют антител от млекопитающих, таких как мыши, кролики и козы. Это создает проблемы, связанные с этическими вопросами, поскольку иммунизация млекопитающих, как правило, требует большого количества животных для получения хорошего урожая, а также частого выполнения процедур, которые приводят к страданиям животных ^6,7. Альтернативой этому является использование антител IgY, выделенных из яичных желтков иммунизированных цыплят, поскольку в желтках могут быть обнаружены высокие концентрации специфических антител против инокулированных антигенов; Производство курицы эквивалентно производству 4,3 кроликов в течение года ^6,7.

Таким образом, целью данного протокола является предоставление метода оценки антител IgY, полученных из желтков куриных яиц, с помощью проточной цитометрии с латексными шариками. Для этого мы предлагаем метод стандартизации цитометрического шарикового иммуноферментного анализа в формате сэндвича с использованием латексных шариков. В качестве модели использовали антитела IgY, направленные на антиген Plasmodium falciparum , богатый гистидином белка II (IgY-PfHRP2). Мы описываем метод экстракции антител, обсуждаем критические этапы определения их связывающей концентрации с латексными шариками и представляем оценку предела обнаружения антигена. Высокая точность проточной цитометрии в сочетании с низкой стоимостью латексных шариков делают этот метод применимым для анализа иммуноферментных инструментов, таких как антитела и антигены. Этот метод может быть использован для обнаружения разноплановых целей.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и инструментам, используемым в этом протоколе.

1. Извлечение IgY из яичных желтков

1. Гигиена яиц
   1. Погрузите яйца (только что снесенные или через 4 дня после снесения, из линии Gallus gallus Dekalb White) в 0,2% разбавленный раствор гипохлорита натрия, быстро промойте под проточной водой и аккуратно протрите для последующего или немедленного использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать сразу, хранить при температуре 4 °C до 15 дней.
2. Отделение желтков
   1. Яйцо аккуратно разбить, а желток отделить от белка с помощью желткового сепаратора.
   2. Излишки белизны удалите с помощью фильтровальной бумаги. Проткните желток и соберите его внутреннюю часть в коническую пробирку объемом 50 мл. Перед употреблением желток храните при температуре −20 °C не менее 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе этих экспериментов (данные не показаны) было замечено, что использование желтков, которые не были предварительно заморожены, препятствовало выделению иммуноглобулинов из липидной части желтков.
3. Подкисление желтков
   1. Разморозьте хранящийся желток и разведите его в соотношении 1:10 в 1 мМ PBS. Доведите рН раствора до 5 с 1 N HCl и инкубируйте раствор при 4 °C в течение 6-24 ч.
   2. Центрифугируют раствор при 3 000 × г в течение 40 мин, извлекают надосадочную жидкость и фильтруют ее с помощью целлюлозного фильтра 0,7 мм.
4. Осаждение липидов каприловой кислотой
   1. Отрегулируйте рН надосадочной жидкости до 5 и добавьте каприловую кислоту (≥98% начальной концентрации) до конечной концентрации 8,7% при постоянном помешивании в течение 30 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем надосадочной жидкости может варьироваться в зависимости от липидной массы, осажденной на стадии 1.3.2. Так, например, к 35 мл надосадочной жидкости, полученной после фильтрации, следует добавить 3,107 мл каприловой кислоты.
   2. Центрифугируют образцы в течение 15 мин при 18 600 × г и отделяют надосадочную жидкость от осажденного материала.
   3. Отрегулируйте рН раствора до 7,4 с использованием 1 М NaOH, количественно определите антитела с помощью анализа Брэдфорда⁸ и храните антитела при −20 °C до момента использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела были получены в концентрации 1 мкг/мкл, которая была проверена с помощью 12% геля SDS-PAGE.

2. Кривая насыщения антител IgY к латексным шарикам

1. Связывание шариков с антителами IgY
   1. Добавьте 21 мкл 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC, начальная концентрация 367 мМ) и 21 мкл N-гидроксисукцинимида (NHS, начальная концентрация 50 мМ) к 21 мкл латексных шариков (4% по массе) и доведите до конечного объема 2,1 мл с отфильтрованным 10 мМ PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон рН раствора ПБС должен быть между 7,2 и 7,4, так как в данной работе наблюдалось отрицательное изменение сцепления и других этапов при использовании раствора вне этого диапазона.
   2. Инкубируют при температуре 22 °C при быстром встряхивании в течение 3 ч.
   3. Добавляют 4 мкг, 2 мкг, 1 мкг, 0,5 мкг, 0,25 мкг, 0,125 мкг и 0 мкг ранее экстрагированного антитела захвата IgY-PfHRP2 (см. этап 1.4.3) в различные микропробирки, содержащие 100 мкл раствора, описанного на стадии 2.1.1 (конечная концентрация гранул 0,04%), и инкубируют в тех же условиях, что описаны на этапе 2.1.2, в течение 16 ч.
   4. Центрифугируют образцы при 857 × г при 15 °C в течение 5 мин, выбрасывают надосадочную жидкость и дважды промывают латексные шарики 500 мкл отфильтрованного 10 мМ PBS (0,008% конечная концентрация гранул) с использованием циклов центрифугирования и ресуспендии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 857 × г, так как в этой работе было замечено, что при превышении этой скорости шарики подвергаются деформациям, которые отрицательно влияют на результат теста.
2. Блокировка бусин
   1. Повторно суспендируйте образцы в 1 мл блокирующего буфера (концентрация конечных гранул 0,004%) (отфильтрованный 10 мМ PBS + бычий сывороточный альбумин, BSA, 5%) и инкубируйте в тех же условиях, как описано на этапе 2.1.2, в течение 2 ч.
   2. После блокировки промыть, как описано в шаге 2.1.4, и повторно выполнить в буфере PBS 10 мМ.
3. Инкубация вторичными антителами против курицы, помеченными Alexa Fluor 488
   1. Добавьте 100 мкл флуоресцентных антикуриных антител (2 мг/мл), разбавленных до 1:2 000 в 10 мМ PBS + 0,5% БСА в каждую микропробирку, как описано в шаге 2.1.3.
   2. Инкубируйте образцы, как описано в шаге 2.1.2, на этот раз в темноте, в течение 30 минут.
   3. Промойте шарики, как показано на шаге 2.1.4, и повторно суспендируйте 250 мкл (0,016% конечная концентрация гранулы), отфильтрованного 10 мМ PBS. Выполните считывание показаний проточного цитометра, как описано в разделе 5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из полученных данных о проценте флуоресценции, обратите внимание на начальную точку формирования плато (1 мкг, как в этом исследовании). Мы рекомендуем использовать вторую точку плато (2 мкг, как показано здесь) для следующих шагов (рис. 1).

Рисунок 1: График анализа методом проточной цитометрии для определения точки насыщения связывания антител IgY-Pf HRP2 с латексными шариками. Ось X представляет концентрацию антител, а ось Y — процент полученной флуоресценции. Критерий Краскела-Уоллиса, стр < 0,0033. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Анализ проточной цитометрии на основе латексных шариков для обнаружения антигена

1. После определения точки насыщения антител IgY к латексным шарикам повторите процесс активации гранул в соответствии с шагом 2.1.1.
   1. Соедините шарики при наблюдаемой концентрации насыщения (как описано в шаге 2.1.3) и инкубируйте в соответствии с шагом 2.1.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В анализах, выполненных с использованием антител IgY-PfHRP2, условие насыщения составляло 2 мкг на каждый 1 мкл латексных шариков.
2. Заблокируйте и промойте бусины в соответствии с шагом 2.2.
3. Инкубация с антигеном
   1. Для определения предела детектирования распределите эквивалент 100 мкл закупки блокированного шарика в пробирки, содержащие различное количество рекомбинантного белка Pf HRP2 (1 мкг/мл) (r PfHRP2, 10 мкг, 1 мкг, 0,1 мкг, 0,01 мкг, 0,001 мкг, 0,0001 мкг и 0 мкг), разведенных в 10 мМ PBS + 0,5% BSA в тройном размере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рекомбинантный белок был разработан в работе Sousa et ^al.9.
   2. Инкубируют растворы гранул с белком rPfHRP2, как описано в шаге 2.1.2, в течение 1 ч.
   3. Выполните промывку, как описано в шаге 2.1.4, и выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования.
4. Инкубация с первичным антителом
   1. Добавьте 2 мкг мышиного антитела IgG против белка rPfHRP2, разведенного в 10 мМ PBS + 0,5% BSA, до конечного объема 100 мкл в каждом образце. Инкубируйте образцы, как описано в шаге 2.1.2, и выбросьте надосадочную жидкость после последнего центрифугирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это антитело было разработано в работе Sousa et ^al.9.
5. Инкубация со вторичным антителом
   1. Добавьте 100 мкл флуоресцентных антимышиных антител (2 мг/мл), разбавленных до 1:2 000 в 10 мМ PBS + 0,5% BSA к каждому образцу. Инкубируют, как описано на этапе 2.1.2, и ресуспендируют в 250 мкл (0,016% конечная концентрация гранул) отфильтрованного 10 мМ PBS. Выполните чтение в соответствии с разделом 5.

4. Показания проточного цитометра образцов

1. Настройка цитометрии: Выравнивание оптических параметров цитометра, соединенного с компьютером
   1. Включите компьютер и проточный цитометр и подождите несколько минут, пока оборудование подключится к компьютеру.
   2. Нажмите на программное обеспечение для цитометрии, установленное на компьютере, и войдите в него. В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр | Стартап | Режим очистки | Жидкости SIT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха и препятствия должны быть удалены в процессе запуска цитометра перед взятием образца.
2. Контроль качества
   1. Используйте реагент для контроля качества для проверки напряжений трубок фотоумножителя и оценки чувствительности цитометра.
   2. Поместите реагент для настройки цитометра и шарики для отслеживания в закрытую полистирольную трубку размером 12 мм x 75 мм.
   3. Аккуратно перемешайте трубку вихревым способом.
3. Приготовление суспензионных валиков
   1. Для определения исходного уровня добавьте 0,5 мл разбавителя (10 мМ отфильтрованного PBS, pH 7) и три капли гранул в пробирку из полистирола размером 12 мм x 75 мм. Осторожно встряхните трубку перед использованием.
   2. В рабочей области программного обеспечения цитометра выберите Цитометр | CST и подождите, пока цитометр отключится от интерфейса программного обеспечения цитометра и подключится к интерфейсу CS&T. Обратите внимание на следующее сообщение в строке состояния программного обеспечения цитометра в нижней части экрана: Отключен цитометр.
   3. Используйте закрытую полистирольную трубку размером 12 мм x 75 мм, содержащую реагент для контроля качества, и присоедините ее к зонду проточного цитометра.
4. Проверка конфигурации цитометра
   1. В окне " Сводка системы" убедитесь, что конфигурация цитометра подходит для эксперимента.
5. Настройка для проверки производительности
   1. Выберите идентификатор установочных бусин, соответствующий лоту исследовательских бусин CS&T.
6. Проверка производительности
   1. Прикрепите пробирку к зонду проточного цитометра и нажмите на окно Setup Control . Выберите «Проверить производительность» и нажмите «Выполнить».
   2. После завершения проверки производительности дождитесь открытия диалогового окна. Выполните одно из следующих действий.
      1. Чтобы просмотреть отчет о производительности цитометра, нажмите «Просмотреть отчет».
      2. Чтобы завершить проверку производительности и вернуться к представлению настройки рабочей области, нажмите кнопку Finish.
      3. Просмотрите окончательный результат анализа морфометрической и флуоресцентной чувствительности, который отображается в сводке системы | Результат работы цитометра со статусом PASSED.
      4. Извлеките пробирку из цитометра. Проверьте результаты работы цитометра, отображаемые в окне «Сводка системы ».

5. Анализ образца с помощью проточной цитометрии

1. Войдите в программное обеспечение цитометра.
   1. В рабочей области программного обеспечения цитометра выберите Цитометр | Режим очистки | Жидкости SIT.
   2. Подстройтесь под рабочее пространство программного обеспечения.
   3. Определите стратегию стробирования на основе морфометрических и флуоресцентных характеристик отрицательных управляющих частиц (шариков без флуоресценции).
   4. Чтобы определить морфометрию клеток, выберите Dot Plot Plot Graphic для анализа параметров FSC-A с помощью SSC-A (дополнительный рисунок 1A).
   5. Определите одиночные ячейки с помощью SSC с помощью точечного графика для анализа SSC-H по оси y и SSC-W по оси x (дополнительный рисунок 1B) и определите отдельные ячейки по FSC с помощью точечного графика для анализа FSC-H по оси y и FSC-W по оси x (дополнительный рисунок 1C).
   6. Для флуоресцентного анализа выберите FL1 Dot Plot Plots с помощью FCS-A. Используйте пробирку из полистирола размером 12 мм x 75 мм, содержащую немаркированные образцы и образцы, предварительно помеченные одноцветным Alexa Fluor 488 (дополнительный рисунок 1D, E).
2. Получение образца методом проточной цитометрии.
   1. Используйте полистирольную трубку размером 12 мм x 75 мм с пробкой, содержащую ранее промаркированные образцы. Тщательно перемешайте содержимое пробирки, прикрепите пробирку к зонду проточного цитометра и щелкните левой кнопкой мыши на Acquire.
   2. Чтобы установить мощность лазеров, нажмите «Параметры» и в опциях ниже установите напряжение FSC на 182 В и напряжение SSC на 236 В. Чтобы установить пороговое значение, нажмите на Цитометр | Threshold, а в параметрах ниже отрегулируйте FSC на 500 В.
   3. Установите вентиль анализа для определения характеристик частиц по размеру и сложности, а также для выполнения анализа отдельных ячеек.
   4. Чтобы удалить автофлуоресценцию, проанализируйте образец без красителей, содержащий только латексные шарики , и отрегулируйте напряжение детектора: в приведенных ниже вариантах отрегулируйте напряжение FL1 (FITC) до 332 В.
   5. Задайте вентиль флуоресцентного анализа в четырехугольном формате от отрицательной точки, показанной на точечном графике.
   6. После настройки морфометрического и флуоресцентного анализов настройте устройство на 50 000 событий: в разделе « Регистрация» нажмите « Запись».

Результаты

На рисунке 2 представлено графическое представление процесса экстракции антител IgY путем подкисления с последующим разделением с помощью каприловой кислоты (рисунок 2).

Обсуждение

Метод осаждения антител IgY путем снижения рН с последующим разделением липидов с помощью каприловой кислоты эффективен для выделения общих антител без потери функциональности. Предложенный здесь метод проще и дешевле, чем тот, о котором сообщили Redwan et ^al.11, в которых также и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey	Sigma-Aldrich	SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2	Sigma-Aldrich	SAB4600388
BD FACSCanto II	BD Biosciences	BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads)	BD Biosciences	655050
BD FACSDiva software 7.0	BD Biosciences	655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	#5000006
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Caprilic acid	Sigma-Aldrich	O3907
Centrifuge 5702 R	Eppendorf	Z606936
Chloride 37% acid molecular grade	NEON	02618 NEON
CML latex, 4% w/v	Invitrogen	C37253
Megafuge 8R	Thermo Scientific	TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)	Sigma-Aldrich	E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	130672-25G
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	1003335620
Sodium hydroxide	Acs Cientifica	P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite	Acs Cientifica	R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool	KASVI	K80-120R