Стандартизация цитометрического анализа на основе антител к яичному желтку

Резюме

В данном протоколе описана методика подготовки латексных шариков для анализов с использованием антител IgY для выявления антигена.

Аннотация

Иммунологические анализы являются важными тестами для обнаружения многочисленных молекулярных мишеней. Среди методов, доступных в настоящее время, цитометрический анализ шариков приобрел известность в последние десятилетия. Каждая микросфера, считываемая оборудованием, представляет собой событие анализа способности к взаимодействию между испытуемыми молекулами. Тысячи этих событий считываются в одном анализе, что обеспечивает высокую точность и воспроизводимость анализа. Эта методология также может быть использована для валидации новых входных данных, таких как антитела IgY, для диагностики заболеваний. Эти антитела получают путем иммунизации цыплят интересующим антигеном и последующего извлечения иммуноглобулина из желтка яиц животных; Таким образом, это безболезненный и высокопродуктивный метод получения антител. В дополнение к методологии высокоточной валидации способности к распознаванию антител в этом анализе, в данной работе также представлен метод извлечения этих антител, определения наилучших условий сопряжения антител и латексных шариков, а также определения чувствительности теста.

Введение

Среди методов иммунологического анализа, направленных на диагностику заболеваний, цитометрический анализ шариков стал высокочувствительным и надежным подходом, поскольку он позволяет анализировать тысячи частиц в одном анализе1^. Этот метод, помимо высокой производительности и возможности использования меньших объемов образцов, также обладает большой гибкостью, поскольку позволяет обнаруживать несколько молекул, таких как цитокины, молекулы адгезии, изотипы антител и белки ^2,3.

Для разработки этих анализов используются различные частицы, ....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и инструментам, используемым в этом протоколе.

1. Извлечение IgY из яичных желтков

1. Гигиена яиц
   1. Погрузите яйца (только что снесенные или через 4 дня после снесения, из линии Gallus gallus Dekalb White) в 0,2% разбавленный раствор гипохлорита натрия, быстро промойте под проточной водой и аккуратно протрите для последующего или немедленного использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать сразу, хранить при температуре 4 °C до 15 дней.
2. Отделение желт....

Результаты

На рисунке 2 представлено графическое представление процесса экстракции антител IgY путем подкисления с последующим разделением с помощью каприловой кислоты (рисунок 2).

Обсуждение

Метод осаждения антител IgY путем снижения рН с последующим разделением липидов с помощью каприловой кислоты эффективен для выделения общих антител без потери функциональности. Предложенный здесь метод проще и дешевле, чем тот, о котором сообщили Redwan et ^al.11, в которых также и.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey	Sigma-Aldrich	SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2	Sigma-Aldrich	SAB4600388
BD FACSCanto II	BD Biosciences	BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads)	BD Biosciences	655050
BD FACSDiva software 7.0	BD Biosciences	655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	#5000006
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Caprilic acid	Sigma-Aldrich	O3907
Centrifuge 5702 R	Eppendorf	Z606936
Chloride 37% acid molecular grade	NEON	02618 NEON
CML latex, 4% w/v	Invitrogen	C37253
Megafuge 8R	Thermo Scientific	TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)	Sigma-Aldrich	E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	130672-25G
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	1003335620
Sodium hydroxide	Acs Cientifica	P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite	Acs Cientifica	R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool	KASVI	K80-120R