Для начала скальпелем сделайте разрез по дорсальной средней линии усыпленной мыши от затылочной до крестцовой области. С помощью стереоскопического хирургического микроскопа тщательно рассекают сквозь слои до поясничного отдела позвоночника. Определите последнюю реберную дугу.
Определите последний шейный позвонок и крестец. Затем сделайте надрез, чтобы отделить позвоночник. С помощью пары рассекающих щипцов выполните дорсальную ламинэктомию позвонка для извлечения спинного мозга.
Удалите нервы, выходящие через отверстия, которые составляют периферическую нервную систему. Теперь поместите извлеченный спинной мозг на препарирующую доску. С помощью ножниц для ванны разрежьте его на кусочки размером два миллиметра.
Затем переложите кусочки в двухмиллилитровую микропробирку с плоским дном. Добавьте в микропробирку один миллилитр рабочего раствора HBSS-LD. Выдерживайте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 25 минут.
Обязательно энергично перемешивайте смесь каждые пять минут. Затем пропустите содержимое каждого сбраживания через ситечко размером 40 микрон. Затем добавьте семь миллилитров HBSS с 2% FBS, чтобы нейтрализовать пищеварение и измельчить оставшуюся ткань.
Перенесите суспензию в 50-миллилитровую коническую пробирку перед центрифугированием при 220 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Теперь используйте микропипетку объемом в один миллилитр, чтобы удалить надосадочную жидкость. Затем ресуспендируйте гранулу в двух миллилитрах HBSS-FBS в новой 15-миллилитровой конической трубке.
Добавьте в пробирку два миллилитра среды с градиентом 90% изотонической плотности и центрифугируйте смесь при 160 г в течение 25 минут при температуре 18 градусов Цельсия. Наконец, с помощью переводной пипетки извлеките интерфазу и перенесите ее в 15-миллилитровую коническую трубку. Промойте клетки 10 миллилитрами PBS, затем центрифугируйте клетки при 220 г в течение пяти минут при пяти градусах Цельсия перед дальнейшими экспериментами.
Очистка извлеченных клеток микроглии дала до 99% выхода клеток, что подтверждено окрашиванием FACS. Наблюдались двойные положительные клетки со средним размером 10 мкм, что согласуется с неактивированной микроглией.
