Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия хозяина и патогена, такие как, как бактериальные патогены вызывают болезни у людей, используя человеческие белки. Основным преимуществом этого метода является он может ответить, если любой патоген может использовать Витронектин для установления инфекции хозяина. Мы сосредоточимся на Vitronectin, принимающий белок, который принимает участие во внеклеточной матрицы, но и функции в качестве ингибитора дополнения в детерминантный путь активации дополнения.
Эти факты очень важны и очень привлекательны для патогенных микроорганизмов, вызывающих болезни у людей. Чтобы подготовиться к цитометрии потока, повторно потекут бактериальные гранулы с 50 микролитров блокирующего буфера, содержащего 250 наномолярных витронектин. Затем инкубировать образцы в течение одного часа при комнатной температуре без тряски.
После инкубации, гранулы бактерий центрифугации на 3500 г в течение пяти минут. Затем, мыть гранулы три раза с помощью PBS и аналогичные шаги центрифугации. После мытья добавьте 50 микролитров первичных овец антигуманных витронектиновых поликлональных антител к бактериальным гранулам при разбавлении от одного до 100 в PBS BSA.
Инкубировать подвеску в течение одного часа при комнатной температуре. Затем, мыть бактерии три раза с PBS, чтобы удалить несвехие антитела. Далее добавьте 50 микролитров PBS BSA, содержащих флуоресцеин изотиоцианат конъюгированных ослов против овец поликлональных антител к грануле.
Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа в темноте. Наконец, после трех шагов стирки, повторно бактериальные гранулы с 300 микролитров PBS и анализировать по потоку цитометрии. Чтобы подготовиться к ELISA, выпределите 100 микролитров белкового раствора в каждую колодец пластины микротитров PolySorp.
Закройте пластину крышкой и храните при четырех градусах по Цельсию на ночь, чтобы облегчить иммобилизацию белка на колодцы микротитровых пластин. Отбросьте раствор из пластины микротитр, наклонив вверх дном над раковиной. Затем, мыть скважины три раза с 300 микролитров PBS на скважину.
Заблокив покрытые колодцы в течение одного часа при комнатной температуре с PBS, содержащим 2,5 процента веса BSA. После удаления блокирующего раствора, мыть скважины три раза с 300 микролитров PBST на скважину. Теперь добавьте к каждому образцу 100 микролитров по 50 наномолярных рекомбинантных его тегами PH.
В контрольные скважины добавьте только 100 микролитров PBS BSA. Инкубировать тарелку в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации отбросьте белковый раствор и удалите несыполненные белки, промыв скважины три раза с помощью 300 микролитров PBST на скважину.
Затем добавьте 100 микролитров PBS BSA, содержащих пероксидос хрена, конъюгированных анти-его поликлональных антител. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре, мыть колодцы три раза с 300 микролитров PBST на скважину. Обнаружить антиген-антитела комплексов, добавив 100 микролитров реагента обнаружения ELISA в каждой хорошо.
Затем добавьте 50 микролитров одной молярной серной кислоты на колодец, чтобы остановить реакцию. Измерьте оптическую плотность скважин на уровне 450 нанометров с помощью микропластиного считыватель. Обездвижить человека Витронектин на амин реактивных датчиков с использованием метода соединения амина в соответствии с руководящими принципами производителя.
Используя PBS, последовательно разбавляйте рекомбинантный ЛИганд PH от нуля до четырех микромолеров и перенесите полученные растворы на 96-ну черную пластину микротитров с плоским дном. Запустите эксперимент при 30 градусах цельсия с помощью биослойного интерферометрии инструмента. Пипетт 10 микролитров по два микрограмма на миллилитр раствора виронектина в PBS на слайде стеклянного микроскопа в качестве одной капли.
Разрешить падение высохнуть на слайде в течение 30 минут при комнатной температуре. Вымойте белковое стекло слайды три раза, окунув их в стакан, содержащий PBS в течение двух секунд, чтобы удалить избыток неокрашенного белка. Теперь добавьте 10 миллилитров свежей культуры Hif в стерильную пластиковую чашку Петри и погрузите стеклянные горки с покрытием в культурную среду.
Инкубировать посуду при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа при тряске при 20 об/мин. После инкубации удалите любые несвехие бактерии, погрузив слайды три раза в стакан, наполненный PBS, прежде чем визуализировать связанные бактерии грам окрашиванием, как описано в текстовом протоколе. Культура A549 эпителиальных клеток, как описано в текстовом протоколе.
После одной стирки и трипсинизации клеток при 37 градусах Цельсия разбавляйте подвес клеток до 5 000 клеток на миллилитр, используя полную среду, содержащую пять микрограммов на миллилитр гентамицина. До бактериальной инфекции, заменить средний в скважинах со средним F12 и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию. Вымойте монослой клетки три раза с одним миллилитром PBS при комнатной температуре.
Затем поместите пластину на лед и 200 микролитров предварительно охлажденной среды F12, содержащей 10 микрограмм на миллилитр витронектина. После инкубации пластины при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа, отбросить раствор путем трубопроводов и мыть слой клетки дважды с одним миллилитром PBS при комнатной температуре. Добавьте 100 микролитров свежеросого дикого типа Hif в F12 medium к каждому хорошо.
Инкубировать пластину в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию. Затем, аспирировать среды с пипеткой и мыть A549 эпителиальных клеток три раза с PBS. Добавьте 50 микролитров на колодец раствора клеточного отслоения и следуйте пятиминутной инкубации при 37 градусах по Цельсию.
Затем добавьте 50 микролитров полной среды F12 на колодец, чтобы остановить энзиматические реакции. Перенесите эпителиальные клетки из каждого хорошо в шесть миллилитров стеклянной трубки, содержащей четыре стеклянных бусинки. Высасыв клетки при комнатной температуре вихрем в течение двух минут.
После разбавления клетки лизать 100 раз, пластины 10 микролитров разбавленного образца на шоколадную агарную тарелку. Подсчитайте колонии после ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию. Для проведения анализа Витронектин-зависимой устойчивости к бактерицидной активности человеческой сыворотки, первой культуры и гранул бактерий, как описано в текстовом протоколе.
После центрифугации, повторно бактериальной гранулы с одним томом Декстроза-Gelatin-Веронал буфера. Теперь добавьте 1500 CFU бактерий к 100 микролитров DGVB плюс плюс содержащие 5%сыворотки. Инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут при тряске при 300 об/мин.
Удалите 10 микролитер aliquot из реакционной смеси на ноль минут и 15 минут. Поместите aliquot на шоколадный агар и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию на ночь. После инкубации шоколадных агарных пластин подсчитайте колонии, появляющиеся на тарелках, и рассчитайте процент убитых бактерий, как описано в текстовом протоколе.
Все клинические изоляты Hif, протестированные в этом исследовании, набрали виронектин на поверхность клетки, определяемую цитометрией потока. Связывание виронектина диким штаммом Hif вызвало сдвиг в популяции, в то время как мутант не связывает Виронектин. Белково-белковые взаимодействия между основным витронектин-связывающим белком PH и витронектином были оценены ELISA.
Результаты указывают на значительное взаимодействие между PH и как vitronectin и положительный контроль по отношению к отрицательному контролю. Взаимодействие между PH и Vitronectin оценивалось в режиме реального времени с использованием биослойной интерферометрии, чтобы иметь сродство 2,2 микромолара. Кроме того, бактериальное отсутствие экспрессии PH на поверхности клетки продемонстрировали снижение приверженности витронектин покрытием стеклянных поверхностей по сравнению с дикими клетками типа.
Кроме того, наличие виронектина на поверхности эпителиальных клеток значительно повысило приверженность Hif. Для оценки комплекторной ингибирования активности витронектина было исследовано убийство при посредничестве сыворотки. Дикие клетки Hif проявляли более высокую устойчивость к сыворотке, чем клетки-мутанты.
При наличии тепловой инактивированной сыворотки бактерий не погибло. Интересно, что дикий тип Hif выставлены снижение выживаемости в Виронектин истощенной сыворотки и пополнения Виронектин увеличение выживаемости бактерий. Тем не менее, штамм мутантов не реагировал на истощение витронектина, потому что он не мог завербовать Витронектин на поверхность клетки.
После освоения, этот метод может быть сделано в течение трех-четырех дней для любого патогена и не забудьте использовать свежую культуру бактериальных патогенов. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как проанализировать Витронектин связывания с патогеном. В дополнение к этому методу, Vitronectin связывания поверхностных белков бактерий могут быть определены с помощью протеомии и западной blotting.
Этот метод важен для исследователей в области взаимодействия хозяина и патогена, а также для изучения механизма вирулентности у бактерий.
