Bu yöntem, insan proteinlerini kullanarak bakteriyel patojenlerin insanlarda hastalığa nasıl yol açtığı gibi konak-patojen etkileşim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, herhangi bir patojenkonak enfeksiyonu oluşturmak için Vitronectin kullanabilirsiniz eğer cevap verebilir. Biz Vitronectin üzerinde durulacak, ekstrasellüler matris yer alan bir konak protein, ama aynı zamanda kompleman aktivasyonu belirleyici bir yol kompleman inhibitörü olarak işlev.
Bu gerçekler çok önemli ve insanlarda hastalığa neden patojenler için son derece çekici. Akış sitometrisine hazırlanmak için, 250 nanomolar Vitronectin içeren 50 mikrolitre bloke edici tampon içeren bakteriyel peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra, titremeden oda sıcaklığında bir saat boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra bakterileri santrifüj ile 3, 500 g'da beş dakika peletleyin. Daha sonra PBS ve benzeri santrifüj adımlarını kullanarak peletleri üç kez yıkayın. Yıkamadan sonra, PBS BSA'da 1 ila 100 seyreltmede bakteriyel pelete 50 mikrolitre birincil koyun antihuman Vitronektin poliklonal antikor ekleyin.
Süspansiyonu oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, bağlı olmayan antikorları temizlemek için pbs ile üç kez bakteri yıkayın. Daha sonra, pellet floresan isotiyoyanat konjuge eşek anti-koyun poliklonal antikorlar içeren PBS BSA 50 mikrolitre ekleyin.
Karanlıkta bir saat oda sıcaklığında kuluçka. Son olarak, üç yıkama adımlarından sonra, PBS 300 mikrolitre ile bakteriyel pelet resuspend ve akış sitometri ile analiz. ELISA'ya hazırlanmak için, Bir PolySorp mikrotiter plakanın her kuyununiçine 100 mikrolitre protein çözeltisi dağıtın.
Kapağı ile plakayı kapatın ve mikrotiter plaka kuyuları üzerine protein immobilizasyonkolaylaştırmak için bir gecede dört derece santigrat de saklayın. Mikrotiter plakadan lavabonun üzerine baş aşağı eğilerek çözeltiyi atın. Daha sonra kuyuları kuyu başına 300 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın.
BSA'nın yüzde 2,5 ağırlık hacmi içeren PBS ile oda sıcaklığında kaplamalı kuyuları bir saat boyunca bloke edin. Engelleme çözeltisini çıkardıktan sonra kuyuları kuyu başına 300 mikrolitre PBST ile üç kez yıkayın. Şimdi, her örneğe 50 nanomolar rekombinant onun etiketli PH 100 mikrolitre ekleyin.
Kontrol kuyularında sadece 100 mikrolitre PBS BSA ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra, protein çözeltisini atın ve kuyuları kuyubaşına 300 mikrolitre PBST ile üç kez yıkayarak bağlanmamış proteinleri çıkarın.
Sonra, at turp peroksidaz içeren PBS BSA 100 mikrolitre eklemek anti-onun poliklonal antikorlar konjuge. Oda sıcaklığında bir saat kuluçkadan sonra kuyuları kuyu başına 300 mikrolitre PBST ile üç kez yıkayın. Her kuyuya 100 mikrolitre ELISA algılama reaktifi ekleyerek antijen-antikor komplekslerini tespit edin.
Sonra, reaksiyonu durdurmak için iyi başına bir azı tanesi sülfürik asit 50 mikrolitre ekleyin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nanometre de kuyuların optik yoğunluğunu ölçün. Amin bağlantı yöntemini üreticinin yönergelerine göre kullanarak amin reaktif sensörlerüzerinde insan Vitronectin immobilize.
PBS kullanarak, rekombinant PH ligand'ı sıfırdan dört mikromolara seri olarak seyreltin ve elde edilen çözeltileri 96-iyi siyah düz alt mikrotiter plakasına aktarın. Deneyi biyo-tabaka interferometri aleti kullanarak 30 derecede çalıştırın. Pipet 10 mikrolitre pbs vitronektin mililitre çözeltisi başına iki mikrolitre tek bir damla olarak bir cam mikroskop slayt üzerine.
Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca slaytüzerinde damla kurumasını bekleyin. Fazla kaplamasız proteini çıkarmak için protein kaplı cam slaytları PBS içeren bir kabın içinde iki saniye süreyle batırarak üç kez yıkayın. Şimdi, steril plastik Petri kabına taze Hif kültürünün 10 mililitreekleyin ve kültür ortamına kaplanmış cam slaytları batırın.
20 RPM'de sallayarak bir saat boyunca 37 santigrat derecede bulaşıkları kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi bağlı bakterileri Gram boyama ile görselleştirmeden önce slaytları PBS ile dolu bir kabın üç kez batırarak bağlanmamış bakterileri çıkarın. Kültür A549 epitel hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi.
37 santigrat derece hücrelerin bir yıkama ve tripsinizasyon sonra, gentamisin mililitre başına beş mikrogram içeren tam bir ortam kullanarak mililitre başına 5, 000 hücreye hücre süspansiyon seyreltmek. Bakteriyel enfeksiyondan önce, kuyularda ki ortamı F12 orta ve inkütün le bir gecede 37 santigrat derecede değiştirin. Hücre monokatmanını oda sıcaklığında bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın.
Daha sonra, buz ve Vitronectin mililitre başına 10 mikrogram içeren önceden soğutulmuş F12 orta 200 mikrolitre plaka yerleştirin. Plakayı bir saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yattıktan sonra, çözeltiyi pipetleme yaparak atın ve hücre tabakasını oda sıcaklığında bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya F12 orta sında taze yetiştirilen Hif yabani türü 100 mikrolitre ekleyin.
Plakayı 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, bir pipet ile orta aspire ve PBS ile Üç kez A549 epitel hücreleri yıkayın. Hücre ayırma çözeltisi kuyubaşına 50 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece beş dakikalık kuluçka ile izleyin.
Daha sonra, enzimatik reaksiyonu durdurmak için iyi başına F12 tam orta 50 mikrolitre ekleyin. Epitel hücrelerini her kuyudan dört cam boncuk içeren altı mililitrelik cam tüpe aktarın. Hücreleri iki dakika girdap yaparak oda sıcaklığında inceleyin.
Hücre lisat100 kat seyreltildikten sonra, bir çikolata agar plaka üzerine seyreltilmiş örnek plaka 10 mikrolitre. Bir gecede kuluçkaya yattaki kolonileri 37 santigrat derecede say. İnsan serumunun bakterisidal aktivitesine vitronektin bağımlı direncin analizini yapmak için, metin protokolünde açıklandığı gibi ilk kültür ve pelet bakterileri.
Santrifüjden sonra, Dekstroz-Jelatin-Veronal tampon bir hacim ile bakteriyel pelet resuspend. Şimdi, 100 mikrolitre DGVB artı %5 serum içeren 1,500 CFU bakteri ekleyin. 300 RPM'de sallayarak numuneyi 15 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Reaksiyon karışımından 10 mikrolitrelik bir aliquot'u sıfır dakika 15 dakikada çıkarın. Çikolata agar üzerine aliquot yerleştirin ve bir gecede 37 derece santigrat plaka kuluçka. Çikolata agar plakaları kuluçka sonra, plakalar üzerinde görünen koloniler saymak ve metin protokolü açıklandığı gibi öldürülen bakterilerin yüzdesini hesaplamak.
Bu çalışmada test edilen tüm Hif klinik izoleleri, akış sitometrisi tarafından belirlenen vitronektini hücre yüzeyine dahil etti. Vitronektinin yabani tip Hif türüne bağlanması popülasyonda bir değişime neden olurken, mutant Vitronectin'i bağlamadı. Majör Vitronektin bağlayıcı protein PH ve Vitronektin arasındaki protein-protein etkileşimleri ELISA tarafından tahmin edildi.
Sonuçlar PH ve hem Vitronektin arasında önemli bir etkileşim ve negatif kontrolgöre pozitif kontrol gösterir. PH ve Vitronektin arasındaki etkileşim, biyo-tabaka interferometrisi kullanılarak gerçek zamanlı olarak 2.2 mikromolar yakınlık olduğu tahmin edilmiştir. Ayrıca, hücre yüzeyinde PH ekspresyonu olmayan bakteriyel eksik yabani tip hücrelere göre Vitronektin kaplı cam yüzeylere azaltılmış yapışma sergiledi.
Buna ek olarak, epitel hücrelerinin yüzeyinde Vitronektin varlığı önemli ölçüde Hif bağlılığını artırdı. Vitronektin'in kompleman inhibe aktivitesini tahmin etmek için serum aracılı öldürme incelendi. Yabani tip Hif hücreleri mutant hücrelere göre daha yüksek serum direnci sergiledi.
Isı yalıtılmış serum varlığında hiçbir bakteri öldürülmedi. İlginçtir, yabani tip Hif Vitronektin tükenmiş serum ve Vitronektin yenilenme azaltılmış sağkalım sergiledi bakteriyel sağkalım arttı. Ancak, mutant suşu Vitronektin'in tükenmesine yanıt vermedi çünkü hücre yüzeyine Vitronectin'i işe alamadı.
Bir kez hakim, bu teknik herhangi bir patojen için üç ila dört gün içinde yapılabilir ve bakteriyel patojenlerin taze kültürünü kullanmayı unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, bir patojene bağlanan Vitronektin analiz etmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bu tekniğe ek olarak, bakterilerin Vitronektin bağlayıcı yüzey proteinleri proteomik ve batı lekeleme kullanılarak tespit edilebilir.
Bu teknik konak-patojen etkileşimi alanında araştırmacılar için önemlidir ve aynı zamanda bakterilerde virülans mekanizmasını keşfetmek için.
