이 방법은 세균성 병원체가 인간 단백질을 사용하여 인간에 있는 질병을 일으키는 원인이 되는 방법과 같은 호스트 병원체 상호 작용 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 어떤 병원체가 호스트의 감염을 확립하기 위해 Vitronectin를 이용할 수 있는지 대답할 수 있다는 것입니다. 우리는 비트론틴에 초점을 맞출 것 이다, 세포 외 매트릭스에 참여 하는 호스트 단백질, 하지만 또한 보완 활성화의 결정 경로에 보완 억제제로 기능.
이 사실은 인간에 있는 질병을 일으키는 원인이 되는 병원체를 위해 아주 중요하고 높게 매력적입니다. 유동 세포측정을 준비하기 위해 250나노몰러 비트론틴을 함유한 블로킹 버퍼 50마이크로리터로 세균성 펠릿을 다시 보습한다. 그런 다음 실온에서 1 시간 동안 샘플을 흔들어주지 않고 배양하십시오.
인큐베이션 후, 5 분 동안 3, 500 g에서 원심 분리에 의해 박테리아를 펠릿. 그런 다음 PBS 및 유사한 원심 분리 단계를 사용하여 펠릿을 세 번 세척합니다. 세척 후, PBS BSA에서 1-100 희석에서 세균 펠릿에 1차 양 항인간 비트로넥틴 폴리클론 항체의 50 마이크로리터를 첨가한다.
실온에서 1시간 동안 서스펜션을 배양합니다. 그런 다음 PBS로 박테리아를 세 번 세척하여 언바운드 항체를 제거합니다. 다음으로, 플루오레세인 이소티오카네이트를 함유한 PBS BSA의 50마이크로리터를 펠릿에 당나귀 항양 폴리클론 항체를 첨가한다.
어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오. 마지막으로, 세 가지 세척 단계 후, PBS의 300 마이크로 리터와 세균 펠릿을 다시 중단하고 유동 세포 측정에 의해 분석. ELISA를 준비하려면 PolySorp 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 100 마이크로리터의 단백질 용액을 분배합니다.
뚜껑으로 접시를 닫고 밤새 섭씨 4도에 보관하여 마이크로티터 플레이트 웰에 단백질의 고정을 용이하게합니다. 싱크대 위로 거꾸로 기울어져 마이크로티터 플레이트에서 용액을 버립니다. 그런 다음 우물당 PBS 300 마이크로리터로 우물을 세 번 씻으시다.
2.5 중량 볼륨 % BSA를 포함하는 PBS와 실온에서 1 시간 동안 코팅 된 우물을 차단합니다. 차단 용액을 제거한 후 우물을 300 마이크로리터당 300마이크로리터로 세 번 세척합니다. 이제 각 샘플에 태그된 그의 태그된 PH를 50 나노몰어로 재조합한 100개의 마이크로리터를 추가합니다.
제어 우물에서 PBS BSA의 마이크로리터 100개만 추가합니다. 상온에서 1 시간 동안 접시를 배양하십시오. 인큐베이션에 따라, 단백질 용액을 버리고 우물당 300 마이크로리터로 우물을 세 번 세척하여 불바운드 단백질을 제거하십시오.
그런 다음, 말 무 과록시다제 를 포함하는 PBS BSA의 100 마이크로 리터를 추가 하여 그의 폴리 클론 항체를 공주한다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후 우물을 300마이크로리터당 300마이크로리터로 세 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 ELISA 검출 시약의 100 마이크로리터를 추가하여 항원 항체 복합체를 검출한다.
그런 다음, 반응을 중지 잘 당 하나의 어음 황산의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450 나노미터에서 우물의 광학 밀도를 측정합니다. 제조업체의 지침에 따라 아민 커플링 방법을 사용하여 아민 반응 성 센서에 인간 Vitronectin을 고정.
PBS를 사용하여 재조합 PH 리간드를 0에서 4 마이크로몰러로 연속적으로 희석하고 결과 용액을 96웰 블랙 플랫 바닥 마이크로티터 플레이트로 전송합니다. 생체 층 간섭 계측기를 사용하여 섭씨 30도에서 실험을 실행합니다. PBS의 Vitronectin의 밀리리터 용액 당 2 마이크로그램의 파이펫 10 마이크로리터가 유리 현미경 슬라이드에 한 방울로 밀어 넣습니다.
실온에서 30분 동안 슬라이드에서 드롭을 건조시키십시오. 단백질 코팅 유리 슬라이드를 PBS가 함유된 비커에 담그고 2초 간 세척하여 코팅되지 않은 과도한 단백질을 제거합니다. 이제 신선한 Hif 배양 10 밀리리터를 멸균 플라스틱 페트리 접시에 넣고 문화 매체에 코팅된 유리 슬라이드를 담급합니다.
20 RPM에서 흔들리며 1 시간 동안 섭씨 37도에서 요리를 배양하십시오. 인큐베이션 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Gram 염색에 의해 바운드 된 박테리아를 시각화하기 전에 PBS로 채워진 비커에서 슬라이드를 세 번 잠급으로써 언바운드 박테리아를 제거하십시오. 문체 프로토콜에 기재된 바와 같이 문화 A549 상피 세포.
섭씨 37도에서 세포의 세척 및 트립시화 후, 젠타마이신의 밀리리터 당 5 마이크로 그램을 포함하는 완전한 배지를 사용하여 셀 현탁액을 밀리리터 당 5, 000 세포로 희석시킵니다. 세균감염 전에 우물의 배지를 F12 배지로 교체하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 실온에서 PBS의 1 밀리리터로 셀 모노레이어를 세 번 씻으시면 됩니다.
그런 다음, 얼음에 접시를 놓고 비트론틴의 밀리리터 당 10 마이크로 그램을 포함하는 미리 냉각 된 F12 배지의 200 마이크로 리터. 1 시간 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 배양 한 후, 피펫팅하여 용액을 폐기하고 실온에서 PBS의 1 밀리리터로 셀 층을 두 번 세척하십시오. F12 배지에 갓 자란 Hif 야생 타입의 마이크로리터 100개를 각 웰에 추가합니다.
섭씨 37도에서 2시간 동안 접시를 배양합니다. 이어서, 파이펫으로 배지를 흡인시키고 PBS로 A549 상피 세포를 세 번 세척한다. 셀 분리 용액의 웰당 50 마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도에서 5분 간 배양합니다.
다음으로, 효소 반응을 막기 위해 우물당 50마이크로리터의 F12 완전 배지를 추가합니다. 상피 세포를 각 우물에서 4개의 유리 구슬을 포함하는 6개의 밀리리터 유리 튜브로 옮기. 2 분 동안 소용돌이를 통해 실온에서 세포를 lyse.
셀 리세이트 100배를 희석한 후 희석된 시료 10마이크로리터를 초콜릿 한천 접시에 접시에 놓습니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 잠복후 식민지를 세워보겠습니다. 인간 혈청의 bactericidal 활성에 대한 Vitronectin 의존성 내성의 분석을 수행하기 위해, 첫 번째 배양 및 펠릿 박테리아는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이.
원심 분리에 따라 덱스트로스-젤라틴-베로날 버퍼의 1부로 세균펠릿을 재차놓는다. 이제 DGVB의 100 마이크로리터와 5%의 혈청을 함유한 박테리아 1, 500 CFU를 추가합니다. 300 RPM에서 흔들리면 15분 동안 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다.
0 분 15 분에서 반응 혼합물에서 10 마이크로 리터 알리쿼트를 제거합니다. 초콜릿 한천에 알리쿼트를 놓고 밤새 섭씨 37도에 접시를 배양합니다. 초콜릿 한천 접시의 잠복 후, 접시에 나타나는 식민지를 계산하고 텍스트 프로토콜에 설명 된 바와 같이 죽은 박테리아의 비율을 계산합니다.
이 연구에서 테스트된 모든 Hif 임상 격리는 유동 세포측정에 의해 결정된 바와 같이 비트론신신을 세포 표면에 모집했다. 야생 형 Hif 변형에 의한 Vitronectin의 결합은 돌연변이가 Vitronectin를 결합하지 않은 반면 인구의 변화를 일으켰습니다. 주요 Vitronectin 결합 단백질 PH와 Vitronectin 사이 단백질 단백질 상호 작용ELISA에 의해 추정되었다.
결과는 PH와 Vitronectin 둘 다 및 부정적인 통제에 대하여 긍정적인 통제 사이 중요한 상호 작용을 표시합니다. PH와 Vitronectin 사이의 상호 작용은 2.2 마이크로몰러의 친화력을 갖기 위하여 bio-layer 간섭을 사용하여 실시간으로 추정되었습니다. 더욱이, 세포 표면에 PH의 발현이 부족한 세균성은 야생형 세포에 비해 비트로넥틴 코팅 유리 표면에 대한 준수를 감소시켰다.
또한 상피 세포의 표면에 Vitronectin의 존재는 Hif의 준수를 크게 향상시켰습니다. Vitronectin의 보완 억제 활동을 추정하기 위해 혈청 매개 살인이 조사되었습니다. 야생형 Hif 세포는 돌연변이 세포보다 혈청 저항성이 높았다.
열 불활성 혈청이 있는 상황에서 박테리아는 죽지 않았습니다. 흥미롭게도, 야생 형 Hif는 비트론틴 고갈 된 혈청에서 생존감소와 비트론틴의 보충으로 세균 생존을 증가시켰습니다. 그러나, 돌연변이 균주는 세포 표면에 Vitronectin를 모집할 수 없기 때문에 Vitronectin 고갈에 반응하지 않았습니다.
일단 마스터되면, 이 기술은 어떤 병원체든을 위해 3 4 일에서 행해질 수 있고 세균성 병원체의 신선한 문화를 사용하는 것을 기억하십시오. 이 비디오를 시청한 후, 비트론틴을 병원균에 결합하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 기술 이외에, 박테리아의 Vitronectin 결합 표면 단백질은 프로테오믹스와 서쪽 얼룩을 사용하여 확인할 수 있습니다.
이 기술은 호스트 병원체 상호 작용의 필드에 있는 연구원을 위해 또한 박테리아에 있는 독성의 기계장치를 탐구하기 위하여 중요합니다.
