Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’interaction hôte-pathogène, comme la façon dont les pathogènes bactériens causent la maladie chez l’homme en utilisant des protéines humaines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut répondre si un agent pathogène peut utiliser vitronectin pour établir l’infection de l’hôte. Nous nous concentrerons sur vitronectin, une protéine hôte qui prend part à la matrice extracellulaire, mais fonctionne également comme un inhibiteur de complément dans la voie déterminante de l’activation de complément.
Ces faits sont très importants et très attrayants pour les agents pathogènes causant des maladies chez l’homme. Pour se préparer à la cytométrie d’écoulement, résuspendez les granulés bactériens avec 50 microlitres de tampon bloquant contenant 250 nanomolaire vitronectin. Ensuite, incuber les échantillons pendant une heure à température ambiante sans trembler.
Après l’incubation, pelleter les bactéries par centrifugation à 3500 g pendant cinq minutes. Ensuite, lavez les granulés trois fois à l’aide de PBS et d’étapes de centrifugation similaires. Après le lavage, ajouter 50 microlitres d’anticorps polyclonals vitronectin antihumains de moutons primaires à la pastille bactérienne à une à 100 dilution dans PBS BSA.
Incuber la suspension pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez les bactéries trois fois avec PBS pour éliminer les anticorps non liés. Ensuite, ajouter 50 microlitres de PBS BSA contenant de la fluorescéine isothiocyanate conjugué âne anticorps polyclonal à la pastille.
Incuber à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité. Enfin, après trois étapes de lavage, réutiliser la pastille bactérienne avec 300 microlitres de PBS et analyser par cytométrie d’écoulement. Pour se préparer à l’ELISA, distribuez 100 microlitres de solution protéique dans chaque puits d’une plaque de microtiter PolySorp.
Fermez la plaque avec le couvercle et conservez-la à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour faciliter l’immobilisation des protéines sur les puits de plaques de microtiter. Jetez la solution de la plaque de microtiter en s’inclinant à l’envers sur l’évier. Ensuite, lavez les puits trois fois avec 300 microlitres de PBS par puits.
Bloquer les puits enduits pendant une heure à température ambiante avec PBS contenant 2,5 pour cent de volume de poids BSA. Après avoir enlevé la solution de blocage, lavez les puits trois fois avec 300 microlitres de PBST par puits. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de 50 nanomolaires recombinant son-marqué PH à chaque échantillon.
Dans les puits de contrôle, ajouter seulement 100 microlitres de PBS BSA. Incuber la plaque pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, jetez la solution protéique et éliminez les protéines non liées en lavant les puits trois fois avec 300 microlitres de PBST par puits.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de PBS BSA contenant du peroxydidase de radis de cheval conjugué anti-ses anticorps polyclonals. Après avoir couvé pendant une heure à température ambiante, lavez les puits trois fois avec 300 microlitres de PBST par puits. Détecter les complexes antigènes-anticorps en ajoutant 100 microlitres de réagen de détection ELISA à chaque puits.
Ensuite, ajouter 50 microlitres d’un acide sulfurique molaire par puits pour arrêter la réaction. Mesurez la densité optique des puits à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaque. Immobiliser la vitronectine humaine sur des capteurs réactifs à l’amine en utilisant la méthode de couplage de l’amine selon les directives du fabricant.
À l’aide de PBS, diluer en série le ligand PH recombinant de zéro à quatre micromolaires et transférer les solutions qui en résultent à une plaque de microtiter noir à fond plat de 96 puits. Exécutez l’expérience à 30 degrés Celsius à l’aide d’un instrument d’interférométrie de biocque. Pipette 10 microlitres d’une solution de deux microgrammes par millilitre de Vitronectin dans PBS sur une lame de microscope en verre comme une seule goutte.
Laisser sécher la goutte sur la lame pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les glissières en verre enduites de protéines trois fois en les trempant dans un bécher contenant du PBS pendant deux secondes pour éliminer l’excès de protéines non enrobées. Maintenant, ajoutez 10 millilitres d’une culture Hif fraîche dans une boîte de Pétri en plastique stérile et submergez les glissières en verre enduit dans le milieu culturel.
Incuber les plats à 37 degrés Celsius pendant une heure avec des secousses à 20 RPM. Après l’incubation, éliminez les bactéries non liées en plongeant les glissières trois fois dans un bécher rempli de PBS avant de visualiser les bactéries liées par gram tacher tel que décrit dans le protocole de texte. Culture A549 cellules épithéliales telles que décrites dans le protocole de texte.
Après un lavage et une trypsinisation des cellules à 37 degrés Celsius, diluer la suspension cellulaire à 5000 cellules par millilitre à l’aide d’un milieu complet contenant cinq microgrammes par millilitre de génycine. Avant l’infection bactérienne, remplacer le milieu dans les puits par F12 moyen et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Lavez la monocouche cellulaire trois fois avec un millilitre de PBS à température ambiante.
Ensuite, placez la plaque sur la glace et 200 microlitres de milieu F12 pré-réfrigéré contenant 10 microgrammes par millilitre de Vitronectin. Après avoir couvé la plaque à quatre degrés Celsius pendant une heure, jetez la solution par pipetting et lavez la couche cellulaire deux fois avec un millilitre de PBS à température ambiante. Ajouter 100 microlitres de type sauvage Hif fraîchement cultivé dans le milieu F12 à chaque puits.
Incuber la plaque pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez le milieu avec une pipette et lavez les cellules épithéliales A549 trois fois avec PBS. Ajouter 50 microlitres par puits de solution de détachement cellulaire et suivre avec une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius.
Ensuite, ajouter 50 microlitres de F12 milieu complet par puits pour arrêter la réaction enzymatique. Transférer les cellules épithéliales de chaque puits dans un tube de verre de six millilitres contenant quatre perles de verre. Lyse les cellules à température ambiante en tourbillonnant pendant deux minutes.
Après diluer la cellule lysate 100 fois, plaque 10 microlitres de l’échantillon dilué sur une plaque d’agar au chocolat. Comptez les colonies après une incubation nocturne à 37 degrés Celsius. Effectuer l’analyse de la résistance dépendante de vitronectin à l’activité bactérienne du sérum humain, la première culture et pelleter les bactéries comme décrit dans le protocole de texte.
Après centrifugation, resuspendez la pastille bactérienne avec un volume de tampon Dextrose-Gélatine-Veronal. Maintenant, ajoutez 1500 CFU de bactéries à 100 microlitres de DGVB plus plus contenant 5% de sérum. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes en secouant à 300 RPM.
Retirer un aliquot de 10 microlitres du mélange de réaction à zéro minute et 15 minutes. Déposer l’aliquot sur une agar au chocolat et incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation des plaques d’agar au chocolat, comptez les colonies apparaissant dans les assiettes et calculez le pourcentage de bactéries tuées tel que décrit dans le protocole textuel.
Tous les isolats cliniques Hif testés dans cette étude ont recruté vitronectin à la surface de la cellule tel que déterminé par la cytométrie de flux. La liaison de Vitronectin par la souche de type sauvage Hif a provoqué un changement dans la population alors que le mutant n’a pas lié Vitronectin. Les interactions protéine-protéine entre la protéine ph et la vitronectin, protéine liant la vitro majeure, ont été estimées par ELISA.
Les résultats indiquent une interaction significative entre PH et vitronectin et le contrôle positif par rapport au contrôle négatif. L’interaction entre PH et Vitronectin a été estimée en temps réel à l’aide de l’interférométrie de biocque pour avoir une affinité de 2,2 micromolaires. En outre, l’expression bactérienne manquante de PH sur la surface de cellules a montré l’adhérence réduite aux surfaces en verre vitronectin-enduites par rapport aux cellules sauvages de type.
En outre, la présence de Vitronectin à la surface des cellules épithéliales a considérablement amélioré l’adhérence de Hif. Pour estimer l’activité inhibitrice complète de Vitronectin, le meurtre sérique- médiatisé a été examiné. Les cellules Hif de type sauvage présentaient une résistance au sérum plus élevée que les cellules mutantes.
Aucune bactérie n’a été tuée en présence de sérum inactivé par la chaleur. Fait intéressant, le type sauvage Hif a montré la survie réduite dans le sérum vitronectin-épuisé et le réapprovisionnement de Vitronectin a augmenté la survie bactérienne. Cependant, la souche mutante n’a pas répondu à l’épuisement de Vitronectin parce qu’elle ne pouvait pas recruter vitronectin à la surface de cellules.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être faite en trois à quatre jours pour n’importe quel agent pathogène et n’oubliez pas d’utiliser la culture fraîche des pathogènes bactériens. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension sur la façon d’analyser la liaison Vitronectin à un agent pathogène. En plus de cette technique, les protéines de surface liant la vitronectine des bactéries peuvent être identifiées en utilisant la protéomique et le ballonnement occidental.
Cette technique est importante pour les chercheurs dans le domaine de l’interaction hôte-pathogène et aussi pour explorer le mécanisme de virulence chez les bactéries.
