Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione ospite-patogeno come il modo in cui gli agenti patogeni batterici causano malattie nell'uomo utilizzando proteine umane. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può rispondere se qualsiasi agente patogeno può utilizzare vitronectina per stabilire l'infezione dell'ospite. Ci concentreremo sulla Vitronectina, una proteina ospite che prende parte alla matrice extracellulare, ma funziona anche come inibitore del complemento nella via determinante dell'attivazione del complemento.
Questi fatti sono molto importanti e molto attraenti per gli agenti patogeni che causano malattie nell'uomo. Per prepararsi alla citometria del flusso, rimorsipare i pellet batterici con 50 microlitri di tampone di blocco contenente 250 vitronectina nanomolare. Quindi, incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente senza tremare.
Dopo l'incubazione, pellet i batteri per centrifugazione a 3.500 g per cinque minuti. Quindi, lavare i pellet tre volte utilizzando PBS e passaggi di centrifugazione simili. Dopo il lavaggio, aggiungere 50 microlitri di anticorpi policlonali di vitronectina antiumani delle pecore primarie al pellet batterico a una diluizione da uno a 100 nel PBS BSA.
Incubare la sospensione per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, lavare i batteri tre volte con PBS per rimuovere gli anticorpi non vincolati. Aggiungere quindi al pellet 50 microlitri di PBS BSA contenenti isotiocianato di fluoresceina anticorpi policlonali di asino coniugato.
Incubare a temperatura ambiente per un'ora al buio. Infine, dopo tre fasi di lavaggio, rimorsi il pellet batterico con 300 microlitri di PBS e analizzare per citometria a flusso. Per prepararsi a ELISA, erogare 100 microlitri di soluzione proteica in ogni pozzo di una piastra di microtitolo PolySorp.
Chiudere la piastra con il coperchio e conservare a quattro gradi Celsius durante la notte per facilitare l'immobilizzazione delle proteine sui pozzi della piastra del microtitolo. Scartare la soluzione dalla piastra del microtitoro inclinando a testa in giù sul lavandino. Quindi, lavare i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBS per pozzo.
Bloccare i pozzi rivestiti per un'ora a temperatura ambiente con PBS contenente 2,5 peso volume percento BSA. Dopo aver rimosso la soluzione di blocco, lavare i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzo. Ora, aggiungete 100 microlitri di 50 nanomolari ricombinanti con PH con tag ad ogni campione.
Nei pozzi di controllo aggiungere solo 100 microlitri di PBS BSA. Incubare il piatto per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione proteica e rimuovere le proteine non abbozzate lavando i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzo.
Quindi, aggiungere 100 microlitri di PBS BSA contenenti perossidasi di ravanello di cavallo coniugato anticorpi anti-suo policlinico. Dopo aver incubato per un'ora a temperatura ambiente, lavare i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzo. Rilevare i complessi antigene-anticorpi aggiungendo 100 microlitri di reagente di rilevamento ELISA ad ogni pozzo.
Quindi, aggiungere 50 microlitri di un acido solforico molare per pozzo per fermare la reazione. Misurare la densità ottica dei pozzi a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastrine. Immobilizzare la vitronectina umana su sensori reattivi all'ammina utilizzando il metodo di accoppiamento delle ammine secondo le linee guida del produttore.
Utilizzando PBS, diluire serialmente il ligando PH ricombinante da zero a quattro micromolari e trasferire le soluzioni risultanti su una piastra microtiter flat-bottom nera da 96 pozzetti. Esegui l'esperimento a 30 gradi Celsius usando uno strumento di interferometria a biostrato. Pipetta 10 microlitri di una soluzione di due microgrammi per millilitro di Vitronectin in PBS su un vetrino da microscopio in vetro come una singola goccia.
Lasciare asciugare la goccia sullo scivolo per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetri rivestiti di proteine tre volte immergerli in un bicchiere contenente PBS per due secondi per rimuovere le proteine non rivestite in eccesso. Ora, aggiungere 10 millilitri di una coltura Hif fresca in una piastra di Petri di plastica sterile e immergere gli scivoli di vetro rivestiti nel mezzo di coltura.
Incubare i piatti a 37 gradi Celsius per un'ora con tremori a 20 giri/min. Dopo l'incubazione, rimuovere eventuali batteri non legati immergendo le diapositive tre volte in un becher pieno di PBS prima di visualizzare i batteri legati mediante colorazione Gram come descritto nel protocollo di testo. Coltura A549 cellule epiteliali come descritto nel protocollo di testo.
Dopo un lavaggio e tripsicinazione delle cellule a 37 gradi Celsius, diluire la sospensione cellulare a 5.000 cellule per millilitro utilizzando un mezzo completo contenente cinque microgrammi per millilitro di gentamicina. Prima dell'infezione batterica, sostituire il mezzo nei pozzi con mezzo F12 e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Lavare il monostrato cellulare tre volte con un millilitro di PBS a temperatura ambiente.
Quindi, posizionare la piastra sul ghiaccio e 200 microlitri di mezzo F12 pre-refrigerato contenente 10 microgrammi per millilitro di Vitronectin. Dopo aver incubato la piastra a quattro gradi Celsius per un'ora, scartare la soluzione pipettando e lavare lo strato cellulare due volte con un millilitro di PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di tipo selvatico Hif appena coltivato in F12 medio ad ogni pozzo.
Incubare il piatto per due ore a 37 gradi Celsius. Quindi, aspirare il mezzo con una pipetta e lavare le cellule epiteliali A549 tre volte con PBS. Aggiungere 50 microlitri per pozzo di soluzione di distacco cellulare e seguire con un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi, aggiungere 50 microlitri di F12 mezzo completo per pozzo per fermare la reazione enzimatica. Trasferire le cellule epiteliali da ogni pozzo a un tubo di vetro da sei millilitri contenente quattro perline di vetro. Lyse le cellule a temperatura ambiente vortice per due minuti.
Dopo aver diluito il litorato cellulare di 100 volte, placcare 10 microlitri del campione diluito su un piatto di agar al cioccolato. Conta le colonie dopo un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. Per eseguire l'analisi della resistenza vitronectina-dipendente all'attività battericida del siero umano, prima coltura e pellet i batteri come descritto nel protocollo di testo.
Dopo la centrifugazione, rimescolare il pellet batterico con un volume di tampone destrosio-gelatina-veronale. Ora, aggiungi 1.500 CFU di batteri a 100 microlitri di DGVB più più contenente il 5% di siero. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti con scuotimento a 300 giri/min.
Rimuovere un'aliquota di 10 microliter dalla miscela di reazione a zero minuti e 15 minuti. Posizionare l'aliquota sull'agar al cioccolato e incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione delle piastre di agar al cioccolato, contare le colonie che appaiono sulle piastre e calcolare la percentuale di batteri uccisi come descritto nel protocollo di testo.
Tutti gli isolati clinici Hif testati in questo studio hanno reclutato Vitronectin sulla superficie cellulare come determinato dalla citometria del flusso. Il legame della vitronectina da parte del ceppo hif di tipo selvatico causò uno spostamento della popolazione mentre il mutante non legava la Vitronectina. Elisa ha stimato interazioni proteina-proteina tra la principale proteina legante vitronectina PH e Vitronectin.
I risultati indicano un'interazione significativa tra PH e vitronectina e il controllo positivo rispetto al controllo negativo. L'interazione tra PH e Vitronectin è stata stimata in tempo reale usando l'interferometria a biostrato per avere un'affinità di 2,2 micromolare. Inoltre, la mancanza batterica di PH sulla superficie cellulare presentava una ridotta aderenza alle superfici di vetro rivestite di Vitronectin rispetto alle cellule di tipo selvatico.
Inoltre, la presenza di Vitronectina sulla superficie delle cellule epiteliali ha migliorato significativamente l'aderenza di Hif. Per stimare l'attività di inibizione del complemento della Vitronectina, è stata esaminata l'uccisione mediata dal siero. Le cellule Hif di tipo selvaggio mostravano una maggiore resistenza al siero rispetto alle cellule mutanti.
Nessun batterio è stato ucciso in presenza di siero inattivato dal calore. È interessante notare che hif di tipo selvatico ha mostrato una ridotta sopravvivenza nel siero impoverito di Vitronectin e il rifornimento di Vitronectin ha aumentato la sopravvivenza batterica. Tuttavia, il ceppo mutante non ha risposto all'esaurimento della vitronectina perché non poteva reclutare Vitronectin sulla superficie cellulare.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni per qualsiasi agente patogeno e ricordarsi di utilizzare la coltura fresca degli agenti patogeni batterici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come analizzare il legame della Vitronectin con un agente patogeno. Oltre a questa tecnica, le proteine superficiali leganti vitronectina dei batteri possono essere identificate usando la proteomica e l'gonfiore occidentale.
Questa tecnica è importante per i ricercatori nel campo dell'interazione ospite-patogeno e anche per esplorare il meccanismo della virulenza nei batteri.
