Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de interação hospedeiro-patógeno, como como patógenos bacterianos causam doenças em humanos utilizando proteínas humanas. A principal vantagem desta técnica é que ela pode responder se algum patógeno pode utilizar a Vitronectin para estabelecer a infecção do hospedeiro. Vamos focar na Vitronectin, uma proteína hospedeira que participa da matriz extracelular, mas também funciona como um inibidor complementar na via determinante da ativação complementar.
Esses fatos são muito importantes e altamente atraentes para patógenos que causam doenças em humanos. Para se preparar para a citometria de fluxo, resuspenha as pelotas bacterianas com 50 microliters de tampão de bloqueio contendo 250 nanomolars vitronectina. Em seguida, incubar as amostras por uma hora em temperatura ambiente sem tremer.
Após a incubação, pelota as bactérias por centrifugação a 3.500 g por cinco minutos. Em seguida, lave as pelotas três vezes usando PBS e passos de centrifugação semelhantes. Após a lavagem, adicione 50 microlitadores de anticorpos policlonais de vitronectina vitronectina primária à pelota bacteriana em uma diluição de 1 a 100 na PBS BSA.
Incubar a suspensão por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave a bactéria três vezes com PBS para remover anticorpos desvinculados. Em seguida, adicione 50 microliters de PBS BSA contendo isothiocianato de fluoresceciano conjugado anticorpos anti-ovelhas policlonais à pelota.
Incubar à temperatura ambiente por uma hora no escuro. Finalmente, após três etapas de lavagem, resuspengue a pelota bacteriana com 300 microliters de PBS e analise por citometria de fluxo. Para se preparar para a ELISA, distribua 100 microliters de solução proteica em cada poço de uma placa microtiter PolySorp.
Feche a placa com a tampa e armazene a quatro graus Celsius durante a noite para facilitar a imobilização da proteína em poços de placas de microtiter. Descarte a solução da placa de microtítida inclinando-se de cabeça para baixo sobre a pia. Em seguida, lave os poços três vezes com 300 microliters de PBS por poço.
Bloqueie os poços revestidos por uma hora em temperatura ambiente com PBS contendo 2,5% de volume de peso por cento BSA. Depois de remover a solução de bloqueio, lave os poços três vezes com 300 microliters de PBST por poço. Agora, adicione 100 microliters de 50 nanomolar recombinando seu PH marcado para cada amostra.
Nos poços de controle, adicione apenas 100 microliters de PBS BSA. Incubar a placa por uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, descarte a solução proteica e remova as proteínas desvinculadas lavando os poços três vezes com 300 microliters de PBST por poço.
Em seguida, adicione 100 microliters de PBS BSA contendo rabanete peroxidase conjugado anti-seus anticorpos policlonais. Depois de incubar por uma hora em temperatura ambiente, lave os poços três vezes com 300 microliters de PBST por poço. Detecte os complexos de anticorpos de antígeno adicionando 100 microlitadores de reagente de detecção ELISA a cada poço.
Em seguida, adicione 50 microliters de um ácido sulfúrico molar por poço para parar a reação. Meça a densidade óptica dos poços em 450 nanômetros usando um leitor de microplacão. Imobilize a Vitronectina humana em sensores reativos de amina usando o método de acoplamento de amina de acordo com as diretrizes do fabricante.
Usando PBS, diluir em série o ligante PH recombinante de zero a quatro micromolares e transferir as soluções resultantes para uma placa de microtiter de fundo plana preta de 96 poços. Execute o experimento a 30 graus Celsius usando um instrumento de interferometria de bio camada. Pipeta 10 microlitros de uma solução de dois microgramas por mililitro de Vitronectin em PBS em um slide de microscópio de vidro como uma única gota.
Deixe a gota secar no slide por 30 minutos em temperatura ambiente. Lave os slides de vidro revestidos de proteína três vezes mergulhando-os em um béquer contendo PBS por dois segundos para remover o excesso de proteína não revestida. Agora, adicione 10 mililitros de uma cultura hif fresca em uma placa de Petri de plástico estéril e submergir os slides de vidro revestidos no meio da cultura.
Incubar os pratos a 37 graus Celsius por uma hora com agitação a 20 RPM. Após a incubação, remova qualquer bactéria desvinculada submergindo os slides três vezes em um béquer cheio de PBS antes de visualizar as bactérias amarradas pela coloração de Gram, conforme descrito no protocolo de texto. Cultura A549 células epiteliais descritas no protocolo de texto.
Após uma lavagem e experimentação das células a 37 graus Celsius, diluir a suspensão celular para 5.000 células por mililitro usando meio completo contendo cinco microgramas por mililitro de gentamicina. Antes da infecção bacteriana, substitua o meio nos poços por f12 médio e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Lave a monocamada celular três vezes com um mililitro de PBS à temperatura ambiente.
Em seguida, coloque a placa no gelo e 200 microliters de meio F12 pré-refrigerado contendo 10 microgramas por mililitro de Vitronectin. Depois de incubar a placa a quatro graus Celsius por uma hora, descarte a solução por pipetação e lave a camada celular duas vezes com um mililitro de PBS à temperatura ambiente. Adicione 100 microliters do tipo selvagem Hif recém-cultivado no meio F12 para cada poço.
Incubar a placa por duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire o meio com uma pipeta e lave as células epiteliais A549 três vezes com PBS. Adicione 50 microliters por poço de solução de descolamento celular e siga com uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione 50 microliters de F12 meio completo por poço para parar a reação enzimática. Transfira as células epiteliais de cada poço para um tubo de vidro de seis mililitros contendo quatro contas de vidro. Lise as células à temperatura ambiente por vórtice por dois minutos.
Depois de diluir a célula lysate 100 vezes, placa 10 microliters da amostra diluída em uma placa de ágar de chocolate. Conte as colônias após uma incubação noturna a 37 graus Celsius. Para realizar a análise da resistência dependente da vitronectina à atividade bactericida do soro humano, primeira cultura e pelota das bactérias, conforme descrito no protocolo de texto.
Após a centrifugação, resuspengue a pelota bacteriana com um volume de tampão Dextrose-Gelatin-Veronal. Agora, adicione 1.500 UFC de bactérias a 100 microliters de DGVB mais além de conter 5% de soro. Incubar a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos com agitação a 300 RPM.
Remova uma alíquota de 10 microliter da mistura de reação a zero minutos e 15 minutos. Coloque a alíquota no ágar de chocolate e incubar a placa a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação das placas de ágar de chocolate, conte as colônias que aparecem nas placas e calcule a porcentagem de bactérias mortas como descrito no protocolo de texto.
Todos os isolados clínicos hif testados neste estudo recrutaram vitronectina para a superfície celular como determinado pela citometria de fluxo. A ligação de Vitronectin pela cepa hif tipo selvagem causou uma mudança na população, enquanto o mutante não ligava a Vitronectin. As interações proteína-proteína entre a proteína principal de ligação de Vitronectin PH e a Vitronectin foram estimadas pela ELISA.
Os resultados indicam uma interação significativa entre a PH e a Vitronectina e o controle positivo em relação ao controle negativo. A interação entre PH e Vitronectina foi estimada em tempo real usando interferometria de bio camada para ter uma afinidade de 2,2 micromolar. Além disso, a falta de expressão bacteriana de PH na superfície celular exibiu menor adesão às superfícies de vidro revestidas de Vitronectin em comparação com células do tipo selvagem.
Além disso, a presença de Vitronectin na superfície das células epiteliais aumentou significativamente a adesão de Hif. Para estimar a atividade inibidora complementar da Vitronectin, foi examinada a matança mediada por soro. Células hif tipo selvagem apresentaram maior resistência sé soro do que células mutantes.
Nenhuma bactéria foi morta na presença de soro inativado pelo calor. Curiosamente, o tipo selvagem Hif exibiu a sobrevivência reduzida no soro esgotado por Vitronectin e a reposição da Vitronectin aumentou a sobrevivência bacteriana. No entanto, a cepa mutante não respondeu ao esgotamento da Vitronectin porque não podia recrutar vitronectina para a superfície celular.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro dias para qualquer patógeno e lembre-se de usar a cultura fresca dos patógenos bacterianos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como analisar a ligação vitronectina a um patógeno. Além dessa técnica, as proteínas superficiais de ligação de vitronectina de bactérias podem ser identificadas usando proteômica e manchas ocidentais.
Essa técnica é importante para os pesquisadores no campo da interação hospedeiro-patógeno e também para explorar o mecanismo de virulência nas bactérias.
