Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Wirts-Pathogen-Interaktionsfeld zu beantworten, wie bakterielle Krankheitserreger Beim Menschen Krankheiten verursachen, indem sie menschliche Proteine nutzen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist es kann beantworten, wenn jeder Erreger Vitronectin zur Etablierung einer Infektion des Wirts nutzen kann. Wir konzentrieren uns auf Vitronectin, ein Wirtsprotein, das an der extrazellulären Matrix teilnimmt, aber auch als Komplementshemmer im determinanten Weg der Komplementaktivierung fungiert.
Diese Fakten sind sehr wichtig und sehr attraktiv für Krankheitserreger, die Krankheiten beim Menschen verursachen. Zur Vorbereitung auf die Durchflusszytometrie setzen Sie die bakteriellen Pellets mit 50 Mikroliter Blockierpuffer n. Chr. mit 250 nanomolar vitronectin auf. Dann inkubieren Sie die Proben für eine Stunde bei Raumtemperatur ohne zu schütteln.
Nach der Inkubation die Bakterien durch Zentrifugieren bei 3, 500 g für fünf Minuten pellet. Dann waschen Sie die Pellets dreimal mit PBS und ähnlichen Zentrifugationsschritten. Nach dem Waschen 50 Mikroliter primärer Schafe antihuman vitronectin polyklonaler Antikörper in das bakterielle Pellet bei einer verdünnungsgemäßen Eins bis 100 in PBS BSA hinzufügen.
Inkubieren Sie die Suspension für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Bakterien dreimal mit PBS, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter PBS BSA mit Fluorescein isothiocyanat konjugierte Esel Anti-Schaf polyklonale Antikörper auf das Pellet.
Bei Raumtemperatur eine Stunde im Dunkeln bebrüten. Schließlich, nach drei Waschschritten, das bakterielle Pellet mit 300 Mikroliter PBS wieder aufsetzen und durch Durchflusszytometrie analysieren. Zur Vorbereitung auf ELISA 100 Mikroliter Proteinlösung in jeden Brunnen einer PolySorp Mikrotiterplatte geben.
Schließen Sie die Platte mit dem Deckel und lagern Sie bei vier Grad Celsius über Nacht, um die Immobilisierung von Protein auf Mikrotiter-Plattenbrunnen zu erleichtern. Entsorgen Sie die Lösung von der Mikrotiterplatte, indem Sie kopfüber über das Waschbecken kippen. Dann waschen Sie die Brunnen dreimal mit 300 Mikroliter PBS pro Brunnen.
Blockieren Sie die beschichteten Brunnen für eine Stunde bei Raumtemperatur mit PBS mit 2,5 Gewichtsvolumen prozents BSA. Nach dem Entfernen der Sperrlösung die Brunnen dreimal mit 300 Mikroliter PBST pro Brunnen waschen. Fügen Sie nun 100 Mikroliter von 50 nanomolaren rekombinanten PH zu jeder Probe hinzu.
Fügen Sie in den Steuerbrunnen nur 100 Mikroliter PBS BSA hinzu. Inkubieren Sie die Platte für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation entsorgen Sie die Proteinlösung und entfernen Sie die ungebundenen Proteine, indem Sie die Brunnen dreimal mit 300 Mikroliter PBST pro Brunnen waschen.
Fügen Sie dann 100 Mikroliter PBS BSA hinzu, die Pferderettichperoxidase konjugierte Anti-seine polyklonalen Antikörper enthalten. Nach einer Stunde Bei Raumtemperatur eine Stunde inkubieren, waschen Sie die Brunnen dreimal mit 300 Mikroliter PBST pro Brunnen. Erkennen Sie die Antigen-Antikörper-Komplexe, indem Sie jedem Brunnen 100 Mikroliter ELISA-Detektionsreagenz hinzufügen.
Dann fügen Sie 50 Mikroliter einer Molschwefelsäure pro Brunnen hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Messen Sie die optische Dichte der Brunnen mit einem Mikroplattenleser bei 450 Nanometern. Immobilisieren Sie humanes Vitronectin auf Amin-reaktiven Sensoren mit dem Amin-Kopplungsverfahren gemäß den Richtlinien des Herstellers.
Mit PBS wird der rekombinante PH-Ligand seriell von Null auf vier Mikromolar verdünnt und die resultierenden Lösungen auf eine 96-well schwarze Flachboden-Mikrotiterplatte übertragen. Führen Sie das Experiment bei 30 Grad Celsius mit einem Bioschicht-Interferometrie-Instrument aus. Pipette 10 Mikroliter einer Zwei-Mikrogramm-Pro-Milliliter-Lösung von Vitronectin in PBS auf ein Glasmikroskop-Dia als einzigen Tropfen.
Lassen Sie den Tropfen auf der Rutsche für 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Waschen Sie die proteinbeschichteten Glasgletten dreimal, indem Sie sie zwei Sekunden lang in ein PBS-haltiges Becherglas tauchen, um überschüssiges unbeschichtetes Protein zu entfernen. Fügen Sie nun 10 Milliliter einer frischen Hif-Kultur in eine sterile Kunststoff-Petrischale ein und tauchen Sie die beschichteten Glasgletten in das Kulturmedium ein.
Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit Schütteln bei 20 Umdrehungen pro Minute. Nach der Inkubation entfernen Sie alle ungebundenen Bakterien, indem Sie die Dias dreimal in einen mit PBS gefüllten Becher tauchen, bevor Sie die gebundenen Bakterien durch Gram-Färbung visualisieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Kultur A549 Epithelzellen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nach einer Spülung und Trypsinisierung der Zellen bei 37 Grad Celsius, verdünnen Sie die Zellsuspension auf 5.000 Zellen pro Milliliter mit einem vollständigen Medium mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin. Vor der bakteriellen Infektion, ersetzen Sie das Medium in den Brunnen mit F12 medium und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellmonolayer dreimal mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur.
Dann legen Sie die Platte auf Eis und 200 Mikroliter vorgekühlten F12 Medium mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Vitronectin. Nachdem Sie die Platte eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubiert haben, entsorgen Sie die Lösung durch Pipettieren und waschen Sie die Zellschicht zweimal mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch angebauten Hif Wildtyp in F12 Medium zu jedem Brunnen hinzu.
Inkubieren Sie die Platte für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Dann das Medium mit einer Pipette aspirieren und die A549 Epithelzellen dreimal mit PBS waschen. Fügen Sie 50 Mikroliter pro Brunnen der Zellablösung Lösung und folgen mit einer fünfminütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter F12 komplettes Medium pro Brunnen hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie die Epithelzellen von jedem Brunnen auf ein sechs Milliliter Glasrohr mit vier Glasperlen. Lyse die Zellen bei Raumtemperatur durch Wirbeln für zwei Minuten.
Nach verdünnter Zelllysat 100-fach, Platte 10 Mikroliter der verdünnten Probe auf eine Schokoladen-Agar-Platte. Zählen Sie die Kolonien nach einer nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius. Zur Durchführung der Analyse der Vitronectin-abhängigen Resistenz gegen die bakterizide Aktivität des menschlichen Serums, der ersten Kultur und des Pellets der Bakterien, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nach der Zentrifugation das bakterielle Pellet mit einem Volumen dextrose-Gelatin-Veronal-Puffer wieder aufsetzen. Fügen Sie nun 1, 500 KBE von Bakterien zu 100 Mikroliter DGVB plus plus enthält 5%Serum. Inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten mit Schütteln bei 300 RPM.
Entfernen Sie ein 10 Mikroliter Aliquot aus der Reaktionsmischung bei null Minuten und 15 Minuten. Legen Sie das Aliquot auf Schokoladenagar und bebrüten den Teller bei 37 Grad Celsius über Nacht. Zählen Sie nach der Inkubation der Schokoladen-Agar-Platten die Kolonien, die auf den Tellern erscheinen, und berechnen Sie den Prozentsatz der getöteten Bakterien, wie im Textprotokoll beschrieben.
Alle in dieser Studie getesteten klinischen Hif-Isolate rekrutierten Vitronectin an die Zelloberfläche, wie durch Durchflusszytometrie bestimmt. Die Bindung von Vitronectin durch den wilden Stamm Hif verursachte eine Verschiebung der Population, während der Mutant Vitronectin nicht bindete. Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen dem großen Vitronectin-bindenden Protein PH und Vitronectin wurden von ELISA geschätzt.
Die Ergebnisse deuten auf eine signifikante Wechselwirkung zwischen PH und Vitronectin und der positiven Kontrolle relativ zur Negativkontrolle hin. Die Wechselwirkung zwischen PH und Vitronectin wurde in Echtzeit mit Bioschicht-Interferometrie auf eine Affinität von 2,2 Mikromolar geschätzt. Darüber hinaus zeigte die bakterielle fehlende Expression von PH auf der Zelloberfläche eine geringere Haftung an vitronectinbeschichteten Glasoberflächen im Vergleich zu Wildtypzellen.
Darüber hinaus hat das Vorhandensein von Vitronectin auf der Oberfläche von Epithelzellen die Adhärenz von Hif signifikant verbessert. Um die Komplementhemmende Aktivität von Vitronectin abzuschätzen, wurde die serumvermittelte Tötung untersucht. Wildtyp Hif-Zellen wiesen eine höhere Serumresistenz auf als mutierte Zellen.
In Gegenwart von hitzeinaktiviertem Serum wurden keine Bakterien abgetötet. Interessanterweise zeigte der wilde Typ Hif ein vermindertes Überleben im von Vitronectin erschöpften Serum und die Auffüllung von Vitronectin erhöhtes bakterielles Überleben. Der mutierte Stamm reagierte jedoch nicht auf die Erschöpfung von Vitronectin, da er Vitronectin nicht an die Zelloberfläche rekrutieren konnte.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Tagen für jeden Erreger getan werden und denken Sie daran, die frische Kultur der bakteriellen Krankheitserreger zu verwenden. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Vitronectin-Bindung an einen Erreger analysieren können. Zusätzlich zu dieser Technik können Vitronectin-bindende Oberflächenproteine von Bakterien durch Proteomik und Western-Blotting identifiziert werden.
Diese Technik ist wichtig für die Forscher auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Interaktion und auch den Mechanismus der Virulenz in Bakterien zu erforschen.
