يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعل بين المضيف والتلوث مثل كيفية مسببات الأمراض البكتيرية تسبب الأمراض في البشر من خلال استخدام البروتينات البشرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تجيب إذا كان أي مسبب للمرض يمكن أن تستخدم Vitronectin لإنشاء العدوى من المضيف. وسوف نركز على Vitronectin، وهو بروتين المضيف الذي يشارك في مصفوفة خارج الخلية، ولكن أيضا يعمل كمثبط مكمل في مسار محدد من تفعيل تكملة.
هذه الحقائق مهمة جدا وجذابة للغاية لمسببات الأمراض المسببة للمرض في البشر. للتحضير لعملية استئصال السيل التدفق، resuspend الكريات البكتيرية مع 50 ميكرولترات من العازلة حظر تحتوي على 250 نانومولار فيترونيككين. ثم، احتضان العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز.
بعد الحضانة، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 3، 500 غرام لمدة خمس دقائق. ثم، وغسل الكريات ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني وخطوات مماثلة الطرد المركزي. بعد غسل, إضافة 50 microliters من الأجسام المضادة للبكتيريا الغنم الأولية Vitronectin بوليكلونل إلى بيليه البكتيرية في تخفيف واحد إلى 100 في PBS BSA.
احتضان التعليق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وغسل البكتيريا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. المقبل، إضافة 50 ميكرولتردات من برنامج تلفزيوني BSA تحتوي على الفلوريسين isoescecyanate مترافق حمار المضادة للأغنام الأجسام المضادة لبولي كلينل إلى بيليه.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام. وأخيرا، بعد ثلاث خطوات الغسيل، resuspend بيليه البكتيرية مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وتحليل بواسطة تدفق cytometry. للتحضير ل ELISA، الاستغناء 100 ميكرولترات من محلول البروتين في كل بئر من لوحة مصغرة بوليسورب.
أغلق الطبق مع الغطاء واخزنه عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لتسهيل تثبيت البروتين على آبار صفيحة microtiter. تجاهل الحل من لوحة microtiter عن طريق إمالة رأسا على عقب على الحوض. ثم، غسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في البئر.
كتلة الآبار المغلفة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2.5 حجم الوزن في المئة BSA. بعد إزالة حل حجب، وغسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميكرولترس من PBST في بئر. الآن ، إضافة 100 ميكروليترس من 50 نانومولار المؤتلف له الموسومة PH لكل عينة.
في آبار التحكم، إضافة فقط 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني BSA. احتضان لوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، والتخلص من محلول البروتين وإزالة البروتينات غير منضمة عن طريق غسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من PBST في البئر.
ثم، إضافة 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني BSA تحتوي على الفجل الحصان بيروكسيديز مترافق المضادة له الأجسام المضادة متعددة النسيلة. بعد احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميكرولتر من PBST في البئر. الكشف عن مجمعات الأجسام المضادة للضد عن طريق إضافة 100 ميكرولترات كاشف للكشف ELISA إلى كل بئر.
ثم، إضافة 50 ميكرولترات من حمض الكبريتيك الضرس واحد في بئر لوقف التفاعل. قياس الكثافة البصرية للآبار في 450 نانومتر باستخدام قارئ microplate. شلّب Vitronectin الإنسان على أجهزة الاستشعار التفاعلية أمين باستخدام طريقة اقتران أمين وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
باستخدام برنامج تلفزيوني، وتخفيف تسلسلي ليغاند PH المؤتلف من صفر إلى أربعة ميكرومولار ونقل الحلول الناتجة إلى 96-جيدا لوحة مسطحة القاع مسطحة القاع. تشغيل التجربة في 30 درجة مئوية باستخدام جهاز قياس التداخل طبقة حيوية. Pipette 10 ميكرولترات من اثنين ميكروغرام لكل ميل ملليلتر من Vitronectin في برنامج تلفزيوني على شريحة المجهر الزجاجي قطرة واحدة.
السماح قطرة لتجف على الشريحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح الزجاجية المغلفة بالبروتين ثلاث مرات عن طريق غمسها في كوب يحتوي على PBS لمدة ثانيتين لإزالة البروتين غير المصقول الزائد. الآن، إضافة 10 ملليلتر من ثقافة Hif الطازجة في طبق بيتري البلاستيك العقيمة وغمر الشرائح الزجاجية المغلفة في وسط الثقافة.
احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز في 20 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة، وإزالة أي بكتيريا غير منضمة عن طريق غمر الشرائح ثلاث مرات في أحد القارص مملوءة برنامج تلفزيوني قبل تصور البكتيريا ملزمة من قبل غرام تلطيخ كما هو موضح في بروتوكول النص. ثقافة A549 الخلايا الظهارية كما هو موضح في بروتوكول النص.
بعد غسل واحد وتريبسينات من الخلايا في 37 درجة مئوية، وتمييع تعليق الخلية إلى 5،000 خلية لكل ملليلتر باستخدام متوسط كامل يحتوي على خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من النبلاء. قبل العدوى البكتيرية، استبدال المتوسطة في الآبار مع F12 المتوسطة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. غسل أحادية الخلية ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
ثم، ضع اللوحة على الجليد و200 ميكرولتر من متوسط F12 المبردة مسبقًا التي تحتوي على 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من Vitronectin. بعد احتضان لوحة في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة، والتخلص من الحل عن طريق الأنابيب وغسل طبقة الخلية مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. إضافة 100 ميكرولترات من نوع البرية هيف الطازجة في F12 المتوسطة لكل بئر.
احتضان لوحة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. ثم، الطامح المتوسطة مع ماصة وغسل الخلايا الظهارية A549 ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 50 ميكرولترات لكل بئر من حل مفرزة الخلية واتبع مع حضانة لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.
بعد ذلك، إضافة 50 ميكروليترس من F12 المتوسطة كاملة في بئر لوقف رد فعل الأنزيمية. نقل الخلايا الظهارية من كل بئر إلى أنبوب زجاجي ستة ملليلتر تحتوي على أربعة حبات زجاجية. lyse الخلايا في درجة حرارة الغرفة عن طريق دوامة لمدة دقيقتين.
بعد تخفيف الخلية 100 أضعاف، لوحة 10 ميكرولترات من العينة المخففة على لوحة أجار الشوكولاته. عد المستعمرات بعد حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. لأداء تحليل المقاومة التي تعتمد على Vitronectin للنشاط الجرثوم من مصل الدم البشري ، والثقافة الأولى و بيليه البكتيريا كما هو موضح في بروتوكول النص.
بعد الطرد المركزي، resuspend بيليه البكتيرية مع حجم واحد من ديكستروز جيلاتين فيرونال العازلة. الآن، إضافة 1،500 CFU من البكتيريا إلى 100 ميكرولترات من DGVB زائد زائد تحتوي على 5٪ مصل. احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في 300 دورة في الدقيقة.
إزالة 10 ميكرولتر aliquot من خليط رد الفعل في دقيقة الصفر و 15 دقيقة. وضع aliquot على أجار الشوكولاته واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد حضانة الشوكولاته أجار لوحات، عد المستعمرات التي تظهر على لوحات وحساب النسبة المئوية للبكتيريا قتل كما هو موضح في بروتوكول النص.
جميع عزل هيف السريرية اختبارها في هذه الدراسة تجنيد Vitronectin إلى سطح الخلية كما يحددها تدفق استئصال الخلايا. ربط Vitronectin من سلالة Hif نوع البرية تسبب في تحول في السكان في حين أن المتحولة لم تربط Vitronectin. تم تقدير التفاعلات البروتينية البروتينية بين بروتين Vitronectin الرئيسي الملزم PH و Vitronectin بواسطة ELISA.
وتشير النتائج إلى تفاعل كبير بين PH و Vitronectin والسيطرة الإيجابية نسبة إلى السيطرة السلبية. وقد تم تقدير التفاعل بين PH و Vitronectin في الوقت الحقيقي باستخدام قياس التداخل في الطبقة الحيوية ليكون تقارب 2.2 ميكرومولار. وعلاوة على ذلك، أظهرت البكتيريا التي تفتقر إلى التعبير عن PH على سطح الخلية انخفاض الالتزام بالأسطح الزجاجية المغلفة فيترونيكين بالمقارنة مع خلايا النوع البرية.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن وجود Vitronectin على سطح الخلايا الظهارية عزز بشكل كبير من التزام Hif. لتقدير النشاط المثبط المكمّل لـ Vitronectin، تم فحص القتل بوساطة المصل. أظهرت خلايا Hif من النوع البري مقاومة مصل أعلى من الخلايا المتحولة.
لم تقتل أي بكتيريا في وجود مصل معطل للحرارة. ومن المثير للاهتمام، أظهرت نوع البرية Hif انخفاض البقاء على قيد الحياة في مصل Vitronectin المنضب وتجديد Vitronectin زيادة البقاء على قيد الحياة البكتيرية. ومع ذلك، لم تستجب السلالة المتحولة لنضوب Vitronectin لأنه لم يتمكن من تجنيد فيترونيككين إلى سطح الخلية.
مرة واحدة يتقن، هذه التقنية يمكن القيام به في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام لأي مسببات الأمراض وتذكر لاستخدام ثقافة جديدة من مسببات الأمراض البكتيرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد حول كيفية تحليل الربط Vitronectin لمسببات الأمراض. بالإضافة إلى هذه التقنية، Vitronectin الربط البروتينات السطحية من البكتيريا يمكن تحديدها باستخدام البروتيوميكس وغرب النشاف.
هذه التقنية مهمة للباحثين في مجال التفاعل بين المضيفين والأمراض وكذلك لاستكشاف آلية الفوعة في البكتيريا.
