Мы используем этот протокол для поиска новых кандидатов вакцины против туберкулеза, но я могу быть применен к другим инфекционным заболеваниям. По сравнению с моделями млекопитающих этот метод обеспечивает экономически эффективную процедуру для предварительного скрининга новых кандидатов вакцины на основе ДНК. Демонстрацией процедуры будет Ханналина Пииппо, техник из нашей лаборатории.
Для начала установите стеклянную капиллярную крышку в V-groove в полярном баре и слегка затяните ручку зажима. Переместите держатель рядом с нитью и осторожно нажмите капилляр через нить и в полярный бар на другой стороне нити. Затем затяните зажимные ручки, установите защитное стекло и нажмите кнопку шкив.
После этого поместите иглы на кусок многоразового клея внутри чашки Петри, чтобы защитить кончики иглы. Во-первых, подготовить смесь инъекций с использованием 0,5 до 12 микрограммов плазмиды в дозе. Подготовь соответствующий объем мастер-микса для количества рыбы в группе.
Поместите капиллярную иглу на липкую сторону куска ленты на соответствующий держатель. Далее, пипетки капли плазмидных доз на кусок лабораторной пленки. После этого используйте наконечник нагрузки для переноса плазмидных капель из пленки в иглу.
Пипетт медленно и осторожно, чтобы избежать трубчатых пузырьков воздуха в иглу. Распоистить микро-манипулятор и источник света. Затем переключитесь на кран давления воздуха в открытое положение.
На передней панели микроинжектора отрегулируйте длину импульса до 10 секунд, используя режим времени. Затем настройте длину пульса с помощью 10-поворотного циферблата. Затем установите иглу на микро-пипетки держателя микро-манипулятора.
Используйте пинцет, чтобы вырезать кончик иглы, чтобы жидкость была выталкивается, и использовать микроскоп для оценки положения иглы. Нажмите на пульт дистанционного переключения ног один раз, чтобы убедиться, что один второй импульс толкает небольшую каплю из иглы. Затем отрегулируйте настройки электропоратора и соедините пинцет с электропоратором.
Чтобы держать рыбу в фиксированном положении во время инъекции использовать кусок губки с пазом вырезать в середине, как обивка. Тщательно замочите губку в системной воде и установите ее в чашку Петри. Используя пластиковую ложку, перенесите обезболированной зебры на влажную губку с вентральной стороной рыбы вниз в паз.
Под микроскопом поместите иглу под углом 45 градусов близко к спинной мышце зебры, а затем найти небольшое пятно без чешуи перед спинным плавником и нажмите иглу в мышцу. Если какой-либо сопротивления ощущается попробовать соседнее место. Используйте переключатель стопы, чтобы постепенно вводить плазмидный раствор в мышцу.
Под микроскопом фенол красный должен быть виден, как он входит в мышечную ткань. Электропорат рыбы сразу после инъекции, поместив пинцет типа электродов на каждой стороне места инъекции. Нажмите кнопку запуска на электропоратор и дайте ему шесть 40-вольтовых 50 миллисекундных импульсов.
Затем аккуратно перенесите рыбу в восстановительный резервуар. Наконец, после анаэтизации рыбы в соответствии с текстовым протоколом, используйте ультрафиолетовый свет, чтобы увидеть выражение EGFP рядом с местом инъекции. В этом протоколе антигены ДНК были клонированы рядом с GFP в векторе экспрессии.
Зебрафиш были введены с ДНК антиген плазмиды внутримышечно с микро инжектором, и место инъекции было электропотери для улучшения потребления плазмидов в клетки. Для визуализации выражение антигена можно визуализировать с помощью микроскопии флуоресценции. В этом случае вблизи места инъекции было обнаружено выражение всех трех белков синтеза антигена GFP, хотя их интенсивность была различной.
Через пять недель после иммунизации микобактериальными антигенами зебры были инфицированы микобактериями маринума. ДЛЯ определения бактериального бремени у каждой рыбы через четыре недели после инфицирования использовался ПЦКР. По сравнению с контрольной группой, рыба, иммунизированная антигеном, показала снижение бактериальных нагрузок после заражения М.маринумом.
При выполнении этого метода важно тщательно спроектировать плазмидную конструкцию, проверить экспрессию антигена и практиковать технику инъекций перед масштабными экспериментами. Этот метод может проложить путь для экономически эффективного доклинического скрининга новых ДНК-кандидатов вакцины у взрослых зебры. Не забывайте, что благополучие животных очень важно, и правильная анестезия имеет важное значение при выполнении этой процедуры.
