Il sistema batterico CRISPR-Cas9 ha notevolmente aumentato le opzioni sperimentali per gli scienziati della vita. Tuttavia, diversi approcci CRISPR dipendono dalla distribuzione simultanea di più RNA guida nelle singole celle. La clonazione del gRNA dell'assembly di stringhe consente la generazione semplice e veloce di vettori di espressione di gRNA multiplex in un unico passaggio di clonazione.
Ma STAgR non è solo semplice, ma è anche efficiente, economico e facile da personalizzare. Per iniziare, aggiungere le sequenze di gRNA N20 ai primer di amplificazione in avanti per la stringa di DNA STAgR come sporgenze. Aggiungere le sequenze di gRNA di senso cinque prime al primer in avanti, primer in avanti Scaffold, per un'impalcatura convenzionale, o al primer in avanti SAM per un'impalcatura contenente MS2.
Successivamente, aggiungere le sequenze di gRNA N20 del complemento inverso alle sequenze primer inverse, scegliendo primer RP, a seconda dei promotori e delle stringhe specifiche utilizzate. Per iniziare a generare i singoli frammenti di clonazione per Gibson Assembly, trasferire 10 microlitri del buffer ad alta fedeltà su un tubo. Aggiungere un microlitro di 10 dNTP milimolari e 0,25 microlitri di entrambi i primer a strapiombo micromolare.
Aggiungere 10 nanogrammi della stringa del modello di DNA, o vettore, e 1,5 microlitri di DMSO. Aggiungere abbastanza acqua per portare il volume finale a 49,5 microlitri, quindi aggiungere 0,5 microlitri di HF polimerasi. Incubare le reazioni su un termociclo, come delineato nel protocollo di testo.
Successivamente, prendere un'aliquota di 5,5 microliter dalla reazione PCR. Aggiungere il colorante di caricamento a tutte le aliquote e caricarlo su un gel di agarosio all'1%. Caricare una scala del DNA appropriata per il dimensionamento ed eseguire il gel in un buffer di funzionamento del gel appropriato a 120 volt per 30 minuti.
Mentre il gel è in funzione, aggiungere cinque microlitri del tampone fornito con l'enzima di restrizione e 0,5 microlitri DpnI ai restanti 44,5 microlitri di reazione PCR vettoriale per rimuovere il modello plasmide residuo utilizzato durante la PCR. Incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Verificare che le ampliconi siano delle dimensioni corrette.
Per iniziare la purificazione del DNA, aggiungere 1,8 microlitri di perline magnetiche per un microlitro di prodotto PCR e mescolare pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per due minuti. Usando un magnete, separare le perline nei frammenti di DNA dal liquido residuo.
Risciacquare il pellet con etanolo al 70% senza rimescolarlo completamente, per lavare le perline. Ripetere questo lavaggio un'altra volta. Utilizzando una pipetta, rimuovere tutto l'etanolo e lasciare asciugare l'aria del pellet.
Quindi aggiungere da 15 a 20 microlitri di acqua e pipettare su e giù per mescolare e sciogliere il pellet. Utilizzare un magnete per separare le perline dal liquido. Trasferire il supernatante trasparente su un nuovo tubo.
Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro per determinare le concentrazioni di DNA. In primo luogo, preparare il buffer di reazione isotermico 5x come descritto nel protocollo di testo. Per il Gibson Assembly Master Mix, combinare 320 microlitri del tampone di reazione isotermico 5x con 697 microlitri di acqua.
Aggiungere 3 microlitri di esonucleasi T5, 20 microlitri di DNA polimerasi e 160 mciroliter di Taq DNA ligasi. Trasferire 7,5 microlitri dell'Assembly Master Mix su un tubo fresco. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di inserto nel vettore, come delineato nel protocollo di testo.
Incubare i campioni a 50 gradi Celsius per 45-60 minuti. Successivamente, conservare i campioni sul ghiaccio, o a 20 gradi Celsius, per la successiva trasformazione. Quando è pronto a trasformare i batteri, scongelare i batteri TOP10 E.Coli chimicamente competenti sul ghiaccio.
Successivamente, aggiungere cinque microlitri del Gibson Mix a 50 microlitri di batteri competenti e mescolare facendo scorrere delicatamente il fondo del tubo. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua o in un blocco di calore di 42 gradi Celsius per 45 secondi per sconvolgire termicamente i batteri.
Quindi, rimettete i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 250 microlitri di mezzo SOC ai batteri e lasciarli recuperare a 37 gradi Celsius in un'incubatrice di scuotimento per 30-45 minuti. Dopo che i batteri si sono ripresi, placcarli su piastre Agar 1,5%LB che contengono 100 microgrammi per ampicillina millilitro.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Per iniziare, preparare almeno due serie di tubi di reazione PCR da 200 microliter per ogni costrutto. Riempire uno dei set di tubi di reazione con mezzo LB da 100 microlitri, contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.
Utilizzando una punta di pipetta sterile, graffiare il materiale biologico da una colonia batterica e stenderlo sul fondo di un tubo di reazione PCR vuoto da 200 microliter. Trasferire immediatamente la punta della pipetta al secondo tubo di reazione corrispondente che contiene il mezzo LB. Ruotare la punta in giro per assicurarsi che alcuni dei batteri siano trasferiti sul supporto LB.
Incubare a 37 gradi Celsius per un uso successivo. Quindi, preparare 10 microlitri di PCR Master Mix per tubo di reazione, come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere 10 microlitri del PCR Master Mix ai tubi di reazione PCR etichettati, senza il supporto LB.
Utilizzando un termociclo, incubare le reazioni come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, aggiungere il colorante di caricamento ai frammenti amplificati e caricarli su un gel di agarosio all'1%. Caricare una scala del DNA appropriata per il dimensionamento ed eseguire il gel in un buffer di funzionamento del gel appropriato a 120 volt per 30 minuti.
Calcola la dimensione teorica dell'amplicon aggiungendo le singole dimensioni dei promotori usati, delle impalcature gRNA e del numero di sequenze N20. Dai risultati della PCR colonia, identificare i cloni batterici, in base alla dimensione corretta della banda, e se è probabile che portino vettori corretti. Utilizzando la corrispondente coltura di 100 microlitri, inoculare una coltura LB overnight da 2,5 millilitri contenente 100 microgrammi per ampicillina millilitro.
Incubare a 37 gradi Celsius per 12 ore. Quindi, utilizzare un mini-kit plasmide commerciale per estrarre il DNA plasmide, secondo le istruzioni del produttore. In questa procedura, la clonazione del gRNA dell'assembly di stringhe viene utilizzata per generare rapidamente plasmidi di espressione gRNA.
Un risultato tipico dei PCR utilizzati per ottenere i pezzi STAgR è visto qui. Le sei ampliconi rappresentano pezzi lineari di DNA, ognuno contenente le singole sequenze gRNA N20 alle loro estremità. La dorsale plasmide è estesa con le sequenze di punta di gRNA1 e gRNA6, e quindi possiede le sovrapposizioni richieste ad altri due PCR per Gibson Assembly.
Dopo la purificazione, è possibile ottenere una resa di DNA di almeno un microgrammo per vettori e inserti. Dopo Gibson Assembly, la trasformazione batterica si traduce in 100-700 colonie batteriche. L'analisi rappresentativa di 22 colonie batteriche, tramite colonia PCR a seguito di un protocollo STAgR con sei cassette gRNA, indica che sette cloni mostrano la dimensione dell'amplicone prevista per l'assemblaggio completo.
Gli altri cloni probabilmente ricevettero vettori STAgR, contenenti da una a cinque cassette gRNA, mentre un clone è completamente vuoto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore. Eseguito correttamente, consente la generazione di una moltitudine di vettori di espressione di gRNA multiplex in meno di una settimana lavorativa.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare attenzione all'assegnazione e alla combinazione corrette di primer di sporgenza N20. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione su come creare i tuoi vettori di espressione dell'RNA guida multiplex.
