Наш протокол позволяет бактериального распространения и отслеживания бремени в экспериментальной модели неонатального сепсиса в режиме реального времени, а также способность соотносить другие маркеры болезни с патогенной нагрузкой. Этот протокол позволяет продольно анализировать сепсис у отдельных неонатальных мышей, предоставляя возможность наблюдать и сравнивать динамику инфекции и распространение бактерий в режиме реального времени. С помощью этого метода может быть проведено доклинческое тестирование вмешательств для неонатального сепсиса, позволяющее контролировать влияние контроля хозяина над бактериями.
Начните с размещения возрастных щенков в высоких или низких дозах помета групп в биобезопасности уровне два кабинета. На послеродовой день три или четыре, запись веса всех щенков до прививки. Загрузите инсулиновые шприцы с помощью PBS или высокой или низкой дозы E.coli lux inoculum в шкаф для биобезопасности и поместите загруженные шприцы на лед.
Поместите новорожденных для введения на чистую поверхность в шкафу биобезопасности и поднимите кожу на затылке, как бы потертого щенка. Вставьте иглу скошенной прямо под кожей в пространстве, созданном между кожей и мышцей. Когда игла может ощущаться под кожей, ввините 50 микролитров инокулента, одновременно выпуская ущипнутую часть кожи, чтобы предотвратить отток назад, затем удалите иглу медленно и с осторожностью.
Когда все щенки были введены таким же образом, вернуть щенков на свои плотины. Сразу же после инъекции и в соответствующие экспериментальные точки времени после этого, поместите клетку с E.coli люкс инфицированных неонатальных мышей и плотины в биобезопасности уровне два ламинарного потока капот и открыть программное обеспечение в микро КТ компьютера. После инициализации системы и ожидания температуры стадии, чтобы зафиксировать на 37 градусов по Цельсию и температуры CCD, чтобы зафиксировать при отрицательном 90 градусов по Цельсию, место до четырех анестезированные щенки на изображение окно в камере визуализации в положении склонны.
Закрой дверь камеры визуализации и выберите вариант изображения люминесценции. Выберите открытый фильтр и следующий и установите фильтр возбуждения, чтобы заблокировать и фильтр выбросов, чтобы открыть. Выберите 500, 520, 560, 580, 600 и 620 нанометров.
Затем изображение щенков, прежде чем вернуть их в клетку с плотиной с мониторингом до восстановления анестезии. В соответствующей экспериментальной конечной точке, в шкафу биобезопасности, облить усыпленный новорожденный с 70% этанола для предотвращения загрязнения и поместить животное на правой стороне. Используйте типсы, чтобы схватить кожу между животом и задней левой ногой и использовать тонкие кончики хирургических ножниц, чтобы сделать разрез кожи.
Затем продолжайте разрез к задней части животного, пока вся селезенка подвергается. Используйте типсы и ножницы, чтобы удалить селезенку из живота и поместить его в раствор, подходящий для его применения вниз по течению. Чтобы получить легкие, очистить кожу грудной клетки полностью и ввода у основания грудины с ножницами провел вертикально, вырезать вверх, пока грудная клетка разделена.
Используйте типсы, чтобы понять правое и левое легкие по отдельности и удалить легкие из грудной полости. Удалите сердце из легочной ткани ножницами. Затем поместите легкое в раствор, подходящий для его применения ниже по течению.
Для выполнения анализа бактериального убийства in vitro поместите неинфицированную селезенку в 40-метровый нейлоновый ситечко в стерильной 60-миллиметровой чашке Петри, содержащей пять миллилитров PBS, дополненной сывороткой из 10%fetal bovine, и используйте стерильный трехмиллилитровый шприц-поршень для дезагрегации ткани в одноклеточную суспензию. Перенесите клетки в 15-миллилитровую центрифугу и соберите их путем центрифугации. Resuspend гранулы в один миллилитр красных кровяных телец лиза буфера на три-четыре селезенки.
После пяти минут при комнатной температуре, мыть селезенки в PBS и повторно гранулы в 250 микролитров PBS дополняется бычьей сыворотки альбумин и два миллимолярной ЭДТА для подсчета. Далее, изолировать Ly6 B2 положительные клетки с соответствующими иммуномагнитными бусинами в соответствии с протоколом производителя и семян обогащенных Ly6 B2 положительных клеток в один раз от 10 до пяти клеток на 100 микролитров полной среды на плотность хорошо в черно-белой пластины 96-хорошо. Подготовка бактериальной инкокулум при желаемом множественности инфекции в окончательном объеме 100 микролитров на колодец и добавить 100 микролитров бактериальной инкулы или среды только для каждого хорошо в течение одного часа инкубации в инкубаторе клеточной культуры.
В конце инкубации замените среду 200 микролитров свежей полной среды, дополненной 100 микрограммами на миллилитр гентамицина, чтобы удалить оставшиеся внеклеточные бактерии и вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры еще на два часа. В конце инкубации и в каждый экспериментальный момент времени после этого, использовать считыватель пластин для измерения люминесценции в каждом хорошо крышкой пластины культуры, прежде чем вернуть пластину в инкубатор культуры клеток до следующего чтения. Хотя большинство животных демонстрируют высокий уровень бактерий в крови в течение 24 часов после заражения, некоторые щенки имеют низкий или обнаружить бактерии в крови, предлагая очистки инфекции к этому моменту времени.
Кроме того, неонатальные Ly6 B2 положительные splenic клетки, инфицированные биолюминесцентной E.coli в течение одного часа до удаления внеклеточных бактерий и последующего лечения гентамицином выразил высокий уровень люминесценции на три часа, что уменьшается с течением времени свидетельствует о бактериальной очистки. Изображения люминесцентных бактерий в реальном времени подтверждают увеличение распространения бактерий и роста неонатальных щенков с течением времени в 10 и 24 часа после инфицирования. Интравитальная визуализация в сочетании с микроКТ облегчает выявление инфекционных очагов в головном мозге, легких и других периферических тканях.
Легкие некоторых высоко инфицированных мышей демонстрируют непрозрачные области, соответствующие воспалительной консолидации, которая ко локализовывания люминесцентных бактериальных сигналов. Эти области предполагаемого воспалительного экссудата не наблюдаются в неинфицированных контрольных легких. Значительное увеличение экспрессии воспалительных цитокинов по отношению к контролю наблюдается также как в низких, так и в высоких инокульных группах, что коррелирует с заметным утолщением альвеолярной стенки, увеличением альвеолярного кровоизлияния и воспалительным проникновением в этих животных.
Самое главное помнить, чтобы выполнить правильную технику при выполнении инъекций и уделять пристальное внимание новорожденных при введении анестезии. Используя этот метод, мы можем визуализировать неонатальный сепсис в режиме реального времени для изучения вмешательств и проведения направленной терапии, направленной на улучшение иммунного ответа.
