Диабетическая ретинопатия является наиболее распространенным микрососудистым осложнением диабета. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы по патофизиологии конечной стадии заболевания пролиферативной диабетической ретинопатии. Этот метод позволяет деконструкции родной трехмерной ткани пейзаж и исследование патофизиологии тканей в живом материале пациента с прямой клинической значимости. Обратитесь к тексту протокола для получения подробной информации об операции и приборов, используемых в вскрытии. Для начала поместите фиброваскулярную ткань, которая была вырезана из человека, переживающий трансконъюнктивальную микроинцизию стекловидной хирургии, в блюдо клеточной культуры, содержащее стерильный PBS. Используя стерео микроскоп вертикального вскрытия, разрежьте фиброваскулярную ткань примерно на один квадратный миллиметр. Погрузите ткань в PBS и удерживайте ткань на месте с микро препарации пинцетом. Сделайте четкие порезы в ткани с стерильным скальпелем, заботясь, чтобы избежать разрыва фиброзкулярной ткани. Поместите каждый отдельный кусок ткани в колодец из 12 хорошо клеточной культуры пластины, содержащей один миллилитр стерильных PBS. Во-первых, подготовить 25 микролитров алицитов раствора фибриногена при комнатной температуре. Поместите один кусок фиброваскулярной ткани в центре колодец 24 хорошо пластины и удалить излишки PBS. Затем добавьте 25 микролитров раствора TA в одну из подготовленных фибриногенных алицитов. И с помощью другой пипетки набор для 50 микролитров смеси по трубопроводу. Обойти смесь на кусок фиброваскулярной ткани и пипетки вверх и вниз, чтобы застраховать часть ткани содержится в капле. Время формирования фибриногена, критическое для трехмерности культуры ex vivo, тестируется в пустой капле, предшествующей встраиванию тканей, как описано в протоколе. Инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры. Через 30-60 минут наклоните пластину, чтобы проверить, что фибрин гель полностью сформирован. Далее, наложение фиброваскулярной ткани фибринов гели с ex vivo культуры среды дополняется апротинина. После этого верните культурные пластины в инкубатор клеточной культуры на желаемый период времени. Во-первых, заменить ex vivo культуры среды с одним миллилитр параформальдегида решение за хорошо, чтобы исправить культур. Через час, промыть гели с тремя пятиминутными PBS моет. Затем замените промывку PBS двумя миллилитров раствора азида натрия на колодец. Храните фиксированные гели при четырех градусах Celsius.Use шпателем из нержавеющей стали в квадрате края, чтобы поднять капли из пластины тщательно, начиная с краев, прежде чем поднять центр капли. Используя круглый краями шпатель передачи капель в отдельных скважин 12 хорошо пластины, содержащей один миллилитр PBS. После этого наклоните пластину на опору и постфиксйте капли одним миллилитром ледяного раствора метанола ацетона в течение одной минуты. Затем, промыть с трех до пяти двух миллилитров моет PBS. Центрифуга блокирующего раствора в течение 15 минут, чтобы удалить любые обломки. Затем наклоните пластину на опору и инкубировать капли в 500 микролитров блокирующего раствора в течение двух часов при комнатной температуре. Подготовка первичной смеси антител в соответствии с текстовым протоколом. Затем используйте круглый шпатель краями для передачи капель на круглую нижнюю пластину 96 хорошо. Инкубировать капли в 30 микролитров первичной смеси антител на каплю в одночасье при четырех градусах по Цельсию. На следующий день перенесите капли на 12 хорошо пластин, содержащих два миллилитров стирального раствора на колодец. Промыть капли тремя пятиминутными стирками. Затем промойте капли девятью 30-минутными стирками. На следующий день, промыть капли три раза с PBS. Подготовка соответствующей флюорофор-конъюгированных вторичных антител смеси в соответствии с текстовым протоколом. Перенесите капли на круглую нижнюю пластину 96 хорошо, как было поменьше продемонстрировано, и инкубировать пластину 30 микролитров вторичной смеси антител в течение четырех часов при комнатной температуре, защищенной от света.Через четыре часа перенесите капли на 12 хорошо пластин, содержащих два миллилитров раствора для мытья на колодец. Во-первых, промыть капли с трех пятиминутных моет. Затем промойте капли четырьмя 30-минутными стирками. На следующий день, промыть капли пять раз с раствором для мытья в течение 30 минут, и три раза с PBS в течение 30 минут. На следующий день перенесите капельки на круглую нижнюю пластину 96 хорошо, как это было ранее продемонстрировано. Counterstain капли с Hoechst ядерного пятна в течение 30 минут при комнатной температуре. Передача капель на 12 хорошо пластины, содержащей два миллилитров PBS на колодец и промыть три раза с PBS. Затем нанесите узкий слой быстрой затвердевания монтажной среды по краям квадратного стекла крышки и дайте ему высохнуть в течение одной минуты. Затем промыть капельку, окунув ее в колодец из 12 хорошо пластины, содержащей деионизированной воды. И перенесите капельку на слайд микроскопа. Далее, обойтись 15 микролитров не-затвердевания анти-увядание монтажа среды на капельу. Аккуратно распоистите крышку стекла над каплей с монтажной средой, обращенной к слайду, и дайте ему осесть. Пусть слайды высохнут в течение двух часов при комнатной температуре и хранить их при четырех градусах по Цельсию на ночь. Наконец, изображение слайдов с вертикально эпифлюоресценции микроскоп оснащен оптической функции секции на 20x или 40x цели. В этом протоколе была подготовлена и изображена фиброваскулярная ткань. Репрезентативные данные показали, что культуры PDR ex vivo вызывают прорастание CD-31 положительного эндотелия и сосудосужного сохранения в ответ на VEGFA. И наоборот, TGF
