Мы разработали простой, быстрый и экономичный метод извлечения геномной ДНК C.elegans, который отлично подходит для классных и исследовательских приложений. Эти протоколы могут быть надежно использованы для быстрого создания шаблонов ДНК из одного или небольшого образца C.elegance для приложений на основе ПЦР. Пользователи, которые не имеют опыта сбора червей или использования микропипеттера, могут бороться с шагами, требующими этих навыков.
Наблюдение за квалифицированным практикующим и практикующим может помочь. Продемонстрировать процедуру будет Фархан Лакдавала, старший аспирант моей лаборатории. Для извлечения ДНК из одного червя Caenorhabditis elegans, во-первых, установите программу лизиса, состоящую из одного цикла при 55 градусах Цельсия в течение 10 минут, а затем 95 градусов Цельсия в течение трех минут в термоциклере.
Для приготовления лизисного раствора сначала добавляют 0,8 микролитра экстракционного раствора из комплекта на внутреннюю стенку 0,2-миллилитра ПЦР-трубки на льду. Затем добавляют 0,2 микролитра раствора тканевого препарата из набора в каплю экстракционного раствора и перемешивают путем облепки. При выборе червя для извлечения ДНК, во-первых, идентифицируют L4 или взрослое животное под рассекающим микроскопом.
Гермафродит L4 может быть идентифицирован по характерной вульве, которая видна как бледный полукруг в середине животного. Чтобы идентифицировать взрослого гермафродита, выберите одно из самых крупных животных на пластине, которое может иметь овальные эмбрионы, видимые в матке. Далее, используя платиновую проволоку, перенесите выбранное животное в раствор.
Чтобы собрать содержимое на дне трубки, центрифугируйте трубку в течение двух-трех секунд при 2000 х г при комнатной температуре. Затем поместите трубку в термоциклер и запустите программу лизиса, установленную ранее. После того, как эта программа лизиса закончится, ненадолго центрифугируйте трубку и положите ее на лед.
Затем добавляют 0,8 микролитра нейтрализационного раствора из комплекта и перемешивают путем пипетки. Опять же, центрифугируйте трубку в течение двух-трех секунд при 2000 х г при комнатной температуре. Если лизат не используется сразу, храните трубку при четырех градусах Цельсия для будущего использования.
Чтобы извлечь ДНК из отдельных червей, также, во-первых, установите программу лизиса одного цикла при 55 градусах Цельсия в течение 10 минут, а затем 95 градусов Цельсия в течение трех минут в термоциклере. Далее готовят раствор лизиса, сначала добавляя два микролитра экстракционного раствора из набора на внутреннюю стенку 0,2-миллилитрной ПЦР-трубки на льду, затем добавляя 0,5 микролитра раствора для приготовления ткани из набора в каплю экстракционного раствора, затем перемешивают содержимое путем пипетирования. После идентификации L4 или взрослых животных используйте платиновую проволоку для переноса достаточного количества животных в раствор.
Затем центрифугируйте трубку в течение двух-трех секунд при 2000 х г при комнатной температуре, затем поместите трубку в термоциклер и запустите ранее установленную программу лизиса. После завершения программы ненадолго центрифугируйте трубку и поместите ее на лед. Затем добавляют два микролитра нейтрализационного раствора из комплекта в трубку и перемешивают путем пипетки.
Опять же, центрифугируйте трубку в течение двух-трех секунд при 2000 х г при комнатной температуре. Если не используется немедленно, храните лизат при четырех градусах Цельсия для будущего использования. Геномная ДНК, извлеченная протоколом, может быть успешно использована в качестве шаблона ПЦР, как коммерческий набор, так и традиционный метод протеиназы K, продуцируемый ДНК с аналогичными уровнями амплификации ПЦР продукта 2100 пар оснований и продукта 500 пар оснований.
Метод набора для лизиса ДНК также предоставил шаблоны ПЦР, эффективные для различных ферментов ДНК-полимеразы. Даже при различных разведениях ДНК, извлеченная из одного животного коммерческим набором, поддерживала амплификацию ПЦР фрагмента ДНК пары оснований 2100 с эквивалентной эффективностью. Однако амплификация фрагмента ДНК из 500 пар оснований варьировалась в зависимости от концентрации шаблона.
Пригодность ДНК, извлеченной либо из одного животного, либо из нескольких животных в качестве шаблона ПЦР для определения генотипа, была дополнительно продемонстрирована успешной амплификацией гена и его мутировавшего варианта. Поскольку этот протокол включает в себя пипетирование небольшого объема реагентов, чтобы обеспечить консистенцию, используйте мастер-смесь для нескольких реакций, хорошую технику трубопроводов и хорошо откалиброванные пипетки. Кроме того, раскручивание содержимого трубки обеспечивает надлежащий лизис.
Этот метод может быть расширен, адаптирован для извлечения геномной ДНК C.elegans для других последующих применений и может быть использован для извлечения ДНК из других видов нематод. Учитывая простоту, скорость, надежность и низкую стоимость протокола, он хорошо подходит как для исследовательских, так и для классных приложений, где время и ресурсы ограничены.
