Детали, представленные в этом протоколе, касаются эквивалентного поколения кожи человека, что часто является технически сложным. Включены новые эквивалентные элементы протокола кожи человека, такие как сосудистая и объемная визуализация. Этот метод позволяет легко построить модель кожи, которая более точно соответствует ткани in vivo для изучения заболеваний, старения и персонализированной медицины.
Наиболее сложной частью этого протокола является переход между погружением и интерфейсом воздух-жидкость. Вероятно, потребуется несколько испытаний, чтобы оптимизировать сроки и уровни носителей для получения последовательных результатов. Для начала добавьте 516 микролитров среды в трубку с холодной крышкой и сразу же добавьте 375 микролитров холодного коллагена, используя пипетку с положительным смещением объемом 1000 микролитров.
Снимите пустой наконечник пипетки и переключитесь на подготовленную 250-микролитровую пипетку с положительным смещением для смешивания. Быстро перемешать, но осторожно, чтобы предотвратить образование лишних пузырьков. Удерживая наконечник в растворе, равномерно перемешивают из разных положений трубки до тех пор, пока раствор не будет однородного цвета, что обычно занимает около пяти циклов пипетки или 10 секунд.
Немедленно рассейте 125 микролитров клейкового коллагена на мембрану 12-луночной культуры. Чтобы обеспечить равномерное покрытие, наклоните пластину и используйте наконечник пипетки, чтобы покрасить мембрану, осторожно распределив коллаген вокруг. Немедленно переместите 12-скважинную пластину в инкубатор для культивации клеток с 37 градусами Цельсия, чтобы она гелеобразной в течение не менее 20 минут.
После периода гелеобразования выньте из инкубатора 12-нубную пластинку целлюлярного коллагена. Извлеките трубку с крышкой 1,7 миллилитра из влажного льда, затем извлеките коллаген из холодильника и поместите его на влажный лед с открытой крышкой. Добавьте 516 микролитров охлаждаемой клеточной суспензии в холодную крышку трубки.
Используйте 1000-микролитровую пипетку, чтобы немедленно перенастроить 375 микролитров холодного коллагенового раствора непосредственно в раствор внутри колпацкой трубки. Вытолкнуть весь коллаген из пипетки в трубку и отбросить наконечник пипетки с положительным смещением. Немедленно переключитесь на 250-микролитровую пипетку и смешайте раствор коллагена После смешивания перенесите 250 микролитров клеточного коллагенового раствора на аклеточные коллагеновые опоры в 12-луночной культурной вставке, затем переместите 12-луночную пластину в инкубатор клеточной культуры 37 градусов Цельсия.
После 30-минутного геля осторожно наклоните пластину, чтобы оценить гелеобразование и убедиться, что коллаген затвердел. Добавьте 500 микролитров и 1000 микролитров смеси в верхнюю и нижнюю камеры вкладыша соответственно. Убедитесь, что коллагеновый гель погружен в море, добавив больше среды, если это необходимо.
Поместите пластину колодца в инкубатор клеточной культуры для ночной инкубации. На седьмой день погружения используйте ручную пипетку для сбора и выбрасывания сред из нижней и верхней камеры каждой конструкции колодца. Чтобы собрать жимы, застрявшие непосредственно под проницаемой мембраной, поместите наконечник пипетки под мембрану, временно выбив вставку с места.
Добавьте один миллилитр эквивалента человеческой кожи или среды HSE, дополненной 5% FPS, в нижнюю камеру каждой скважины и 200 микролитров клеточной суспензии в верхнюю камеру каждой скважины. Посейте кератиноциты непосредственно на поверхность дермальной конструкции и дайте им поселиться в течение двух часов в инкубаторе. Через два часа после посева кератиноцитов аккуратно добавьте в верхнюю камеру каждого конструктного колодца 300 микролитров среды HSE, дополненных 5%FPS.
После загрузки носителя поместите конструкцию обратно в инкубатор. Используя ручную пипетку, поднимите каждую конструкцию на их воздушно-жидкостный интерфейс или ALI, удалив отходы среды только из верхней камеры. Постарайтесь подойти как можно ближе к эпидермальному слою, не прикасаясь к нему и не повреждая его.
Наклоните пластины немного под разными углами, чтобы собрать среду, затем добавьте примерно два миллилитра стерильной воды в окружающие колодцы в плите для поддержания постоянной влажности. Проверьте пластину через несколько часов, чтобы убедиться, что кератиноциты все еще находятся в ALI. Удалите все носители в верхней камере, отслеживая, сколько носителей удалено из каждой скважины.
Эпидермальные слои должны выглядеть гидратированными, а не сухими, но на верхней части конструкции не должно быть среды. Чтобы подготовить конструкцию к иммунофлуоресцентной окрашиванию, переверните вставку вверх дном и поместите ее над своим колодцом на пластине колодца. Стабилизируем вставку одной рукой, используя тонкие наконечники щипцов или прецизионный нож, чтобы разрезать около половины окружности мембраны.
Отрежьте как можно ближе к пластиковому корпусу. Используя тонкие щипцы наконечника, захватите край клапана разрезанной мембраны и аккуратно отклейте пористую мембрану от вставки, а также конструкции VHSE. Если конструкция застряла на боковой стороне камеры, используйте тонкие щипцы или небольшую совок, чтобы переместить ее в колодец.
Как только VHSE будет в скважине, отбросьте все оставшиеся куски мембраны вставки и держите корпус вкладыша культуры в каждой скважине, чтобы удерживать VHSE в подводном положении во время окрашивания. За два дня до визуализации приготовьте полидиметилсилоксан или PDMS. Поместите любой чистый смеситель на весы и обложите весы тарой.
Добавьте базу, затем добавьте кросслинкер. Энергично перемешайте раствор в течение не менее четырех минут, создавая небольшие пузырьки. После достаточного перемешивания перелейте PDMS в 90 или 100-миллиметровую чашку Петри.
Дегазируйте PDMS в вакуумной камере до тех пор, пока все пузырьки не исчезнут и PDMS не будет очищена. Медленно отпустите вакуум и удалите PDMS. Поместите блюдо в духовку, чтобы вылечить на ночь при 50-60 градусах Цельсия, убедившись, что блюдо сидит ровно для PDMS, чтобы вылечить равномерно.
За день до визуализации используйте стальной перфоратор или ручной прецизионный нож, чтобы пробить или вырезать круглый колодец из листа PDMS, примерно того же размера, что и конструкция VHSE. Вырежьте квадратный участок вокруг круглого колодца, чтобы создать один колодец PDMS. С помощью стеклянной крышки такого же размера, как PDMS, хорошо добавить цианоакрилатный клей на нижнюю поверхность PDMS и равномерно смазать одноразовым наконечником пипетки.
Центрируйте стекло и прижмите его к PDMS, оставляя прозрачное стеклянное окно внутри перфорированного круга. Дайте клею высохнуть в течение ночи перед использованием. Характеристика эпидермиса и дермы показывает соответствующие иммунофлуоресцентные маркеры для кожи человека в конструкциях VHSE.
Цитокератин 10 является маркером ранней дифференцировки кератиноцитов, который обычно отмечает все надбазальные слои в кожных эквивалентах. Инволюкрин и филаггрин являются маркерами поздней дифференцировки в кератиноцитах и отмечают верхние наиболее супрабосальные слои в кожных эквивалентах. Очистка VHSE позволила получить простую визуализацию в одном месте и устранила необходимость переориентировать конструкцию для изображения дермы и эпидермиса отдельно.
Объемные изображения позволяют генерировать 3D-рендеры для отображения сосудистой азкулятуры по каждой конструкции. Стеки изображений были загружены в вычислительное программное обеспечение, а пользовательский алгоритм использовался для 3D-рендеринга и количественной оценки. Скелетонизация определяла окончательный центр каждого сосуда с коллагеновой маркировкой IV, и полученные данные использовались для расчета диаметра сосуда, а также сосудистой фракции.
После этой процедуры могут быть выполнены методы характеристики, такие как барьерный анализ, сканирующая электронная микроскопия, липидные профили и другие, чтобы понять, как сосудистая система конкретно влияет на созревание и стабильность эпидермиса. Этот протокол позволяет проводить тканевые и клеточные исследования в васкуляризированной модели кожи. Он особенно подходит для исследований в области старения и персонализированной медицины.
