Протокол анализа цитотоксичности с использованием клеточных линий рыбок данио-рерио может ответить на вопросы, касающиеся острой токсичности химических веществ на рыбе, или помочь определить соответствующие тестовые концентрации для других альтернативных анализов рыб. Основным преимуществом этого 96-луночного планшетного анализа является объединение различных конечных точек жизнеспособности для определения цитотоксичности клеток рыбок данио, которые являются важным видом рыб в исследованиях экотоксичности. Протокол очень прост.
Если вы правильно выполните все описанные шаги, не должно возникнуть никаких проблем. Этот протокол помогает не проводить исследований экотоксичности на животных, оценивая эффекты в клеточных линиях рыб, полученных из разных органов или стадии жизни, таких как гепатоциты в эмбриональных клетках. Чтобы начать покрытие клеток ZEM2S или ZFL, рассчитайте объем соответствующих клеточных суспензий, необходимых для получения желаемого количества клеток для анализов.
Заполните стерильный резервуар с реагентом полной питательной средой для соответствующей клеточной линии и перенесите рассчитанный объем клеточной суспензии в резервуар для общего объема 20 миллилитров. Используя многоканальную пипетку, аккуратно перемешайте раствор вверх и вниз, не образуя пены или пузырьков. Затем с помощью многоканальной микропипетки добавьте 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку прозрачной полистирольной 96-луночной пластины, чтобы получить жизнеспособное количество клеток 60 000 клеток на лунку для клеток ZEM2S и 40 000 клеток на лунку для клеток ZFL.
Инкубируйте тарелку при температуре 28 градусов Цельсия в течение 24 часов. Чтобы подвергнуть любой тип клеток воздействию различных концентраций исследуемых химических веществ, приготовьте желаемую концентрацию исследуемых химических растворов в питательной среде для интересующей клеточной линии без эмбриональной бычьей сыворотки или FBS. После 24-часовой инкубации аккуратно выбрасывайте отработанные среды из лунок с помощью многоканальной микропипетки.
Затем добавьте 100 микролитров конкретного испытуемого химического раствора на лунку в технических тройках, что означает три лунки для каждой исследуемой концентрации химического вещества. Поместите контрольные группы на ту же табличку, что и исследуемые химические вещества в технических трех экземплярах. Для холостого контроля добавьте 100 микролитров экспонирующей среды в три бесклеточные лунки.
Для отрицательного контроля добавьте 100 микролитров экспонирующей среды в три лунки, содержащие клетки. Для положительного контроля подвергните три лунки, содержащие клетки, воздействию 1%-ного раствора Triton X-100, приготовленного в среде воздействия. Запечатайте пластины парапленкой или клейкой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение питательной среды, и инкубируйте пластины при температуре 28 градусов Цельсия в течение 24 часов.
Через 24 часа после испытательного химического воздействия осторожно выбросьте среду воздействия из лунок, вылив содержимое в сборный лоток, и промойте каждую лунку 200 микролитрами PBS. Затем, чтобы удалить PBS без потери ячеек, осторожно вылейте его в лоток для сбора. Для проведения анализов Alamar Blue или AB и CFDA-AM добавьте 100 микролитров соответствующего раствора на лунку и инкубируйте планшет в течение 30 минут в темноте при температуре 28 градусов Цельсия.
Затем измерьте флуоресценцию в считывателе флуоресцентных пластин при подходящих длинах волн возбуждения и излучения, упомянутых в тексте. Для проведения нейтрального красного или NR-анализа возьмите рабочий раствор NR с концентрацией 40 мкг на миллилитр и центрифугу при 600 г в течение 10 минут. Далее аккуратно удаляют из скважин ранее добавленные растворы AB и CFDA-AM, выливая содержимое в сборный лоток.
С помощью многоканальной микропипетки добавляют 100 микролитров рабочего раствора NR на лунку и выдерживают пластину при 28 градусах Цельсия в течение трех часов. После окончания инкубации осторожно вылейте раствор NR из тарелки в сборный лоток и промойте лунки, добавив 150 микролитров PBS на лунку. После промывки добавьте 150 микролитров экстракционного раствора NR на лунку и инкубируйте пластину, осторожно встряхивая ее на шейкере в течение 10 минут, прежде чем измерить поглощение на 540 нанометрах с помощью планшетного считывателя.
Для проведения анализа МТТ после 24-часового тестового химического воздействия осторожно удалите экспонирующую среду, вылив содержимое в сборный лоток и с помощью многоканальной микропипетки добавьте 100 микролитров рабочего раствора МТТ на лунку в темноте. Инкубируйте тарелку при температуре 28 градусов Цельсия в течение четырех часов в темноте. Затем выбросьте раствор МТТ, вылив содержимое в сборный лоток, и добавьте 100 микролитров ДМСО в каждую лунку для извлечения кристаллов формазана.
Инкубируйте пластину на шейкере в течение 10 минут, прежде чем измерять поглощение на 517 нанометрах с помощью считывателя пластин. Для анализа AP лунки, соответствующие глухим, положительным контрольным и высокоцитотоксическим концентрациям исследуемых химических веществ, показали синий цвет и низкую флуоресценцию, что указывает либо на отсутствие, либо на уменьшение жизнеспособных клеток. Напротив, лунки, соответствующие низким цитотоксическим концентрациям исследуемого химического вещества и отрицательному контролю, содержащему большое количество жизнеспособных клеток, превращали резазурин в розовый резоруфин, имеющий более высокую флуоресценцию.
Для анализа NR высокоцитотоксические концентрации исследуемых химических веществ и положительный контроль являются прозрачными или бледно-розовыми с низкой абсорбцией, в то время как лунки, содержащие жизнеспособные клетки, сохраняющие краситель NR, показали темно-розовый цвет и высокую абсорбцию. Точно так же для анализа МТТ лунки без жизнеспособных клеток прозрачны, в то время как те, которые содержат жизнеспособные клетки, превращают МТТ в формазан фиолетового цвета. На основе рассчитанного процента жизнеспособности клеток была оценена половина максимальной концентрации ингибитора или значение IC50 для различных тестируемых химических веществ в клеточных линиях ZFL и ZEM2S.
Для культур с FBS и без них существенных различий в жизнеспособности клеток не наблюдалось, что указывает на пригодность питательных сред, лишенных FBS, в течение периода химического воздействия 24 часа. Анализы MTT и NR не показали существенного влияния различных концентраций ДМСО от 0,1% до 1% на жизнеспособность клеток, что указывает на то, что эти клеточные линии поддерживают использование ДМСО в качестве растворителя до 1%Обратите особое внимание при обращении с клетками с покрытием, чтобы избежать самоотслоения в течение всей процедуры, и тщательно подготовьте нейтральный красный рабочий раствор, чтобы избежать осаждения красителя. Эта процедура может быть применена к исследованиям, посвященным нескольким аспектам химического воздействия на рыб с использованием моделей in vitro, и способствовать прогрессу исследований экотоксичности на животных.
