Этот протокол является первым ввести стандартизированные ушиб типа ушиба в axolotl спинного мозга регенерации исследований. Основным преимуществом этой техники является то, что она имитирует травмы видели в повседневной клинике, повышение вероятности того, что будущий вывод будет в состоянии быть переведены. Ушиб травмы устройство может быть использовано в любой другой модели малых животных травмы спинного мозга.
Хирургическая техника сложна, особенно ламинэктомия. Поэтому, желательно, чтобы обучить процедуру на большое количество животных ex vivo, прежде чем прогрессирует в in vivo хирургии. Для начала навелит хирургический стол, поместив стандартную чашку Петри под стерео микроскоп, поверх хирургической текстильной ткани.
Поместите анестезироватый аксолотль в положение, подверженное воздействию, на чашку Петри и оберните ее бумажными полотенцами так, чтобы хвост был выставлен. Определите задние конечности и используйте ножницы микро, чтобы сделать первый разрез просто caudal к ним. Сделайте вертикальный разрез с киля до тех пор, пока не будет ощущаться костлявая известность спинных процессов.
Расширьте разрез боковой, так что разрез пересекает всю ширину хвоста, и захватывает спинные процессы с типсами, чтобы обеспечить надлежащую глубину. Затем удлините вертикальный разрез на один миллиметр ниже спинного процесса с обеих сторон. Поместите животное на одну сторону, и, начиная с брюшной точки вертикального разреза, сделать горизонтальный разрез примерно 15 миллиметров для животных, которые от 10 до 20 граммов в весе.
Используйте ножницы, чтобы вскрыть сразу через горизонтальный разрез, пока позвоночные колонки ощущается в средней линии. Затем поверните животное на другую сторону и повторите процесс. После вскрытия в глубокой медиальной плоскости с обеих сторон, вскрыть через середину, чтобы соединить два горизонтальных разрезов.
Затем перемести свободный кусок хвоста и киля в одну сторону, чтобы разоблачить спинные процессы. Поместите животное в положение склонны с головой перед недоминантной стороны хирурга, и использовать пару типсов, чтобы понять спинные процессы, просто caudal на задние конечности. Нанесите нежный подъем вверх и к голове животного.
Поместите лезвия пары микро ножниц горизонтально вокруг процесса и аккуратно разрезать его, подвергая спинного мозга. Возьмитесь за спинной процесс caudal к одному только что удалены, и повторить процесс. Крайне важно, чтобы вы держите постоянный подъем на спинной процесс, чтобы убедиться, что он не наносит ущерб спинного мозга при удалении.
Если открытый район недостаточно широк, используйте две пары типсов, чтобы схватить ламина по обе стороны спинного мозга и скрутить их боковой с нежным движением. При удалении спинового процесса, возможно, необходимо сделать это в несколько шагов. Таким образом, разоблачение спинного мозга может занять несколько минут.
Чтобы ввести ушиб типа ушиба, используйте чашку Петри, чтобы перенести животное в травматологическое отделение и сиять фонариком на спинном мозге. Затем поместите цилиндр контузионной травмы над открытым спинным мозгом с помощью микрорегулиров и опустите цилиндр до тех пор, пока он не выровнется с ламинами. Прикрепите падающий стержень к электромагниту и поместите желаемый цилиндр регулировки высоты на травматологический блок.
Затем поместите падающий стержень на цилиндр, выключите электромагнит, чтобы сбросить стержень на открытый спинной мозг, и используйте винт регулировки высоты, чтобы поднять стержень обратно вверх. При введении резкой травмы, сократить спинной мозг в идеальный вертикальный разрез, а затем повторить разрезы два миллиметра в хвостовой части тела. Почувствуйте лезвия ножниц соскабливания вдоль брюшной части спинного канала, чтобы убедиться, что разрезы завершены, и поднять кусок спинного мозга из канала.
Чтобы закрыть хирургическую рану, поместите 10 точки O нейлоновые швы из наиболее caudal часть горизонтального разреза закрытия раны в один слой и работает в направлении вертикальной части разреза. Когда угол достигнут, поверните чашку Петри и шов другой горизонтальный разрез, а затем установить швы на вертикальные разрезы. Перед прекращением анестезии используйте высокочастотное УЗИ для получения изображений травмы.
Выровняй кончик преобразователи с осью длины животного и погрузи его в раствор бензокаина, пока он не будет всего на несколько миллиметров выше киля за задними конечностями животного. Определите место повреждения и приобретйте изображения в соответствии с рукописными указаниями. После завершения, верните аксолотль в обезболивающее свободное решение, погрузив чашку Петри в пять сантиметров глубиной пресной воды и позволяя животному соскользнуть.
Травмы спинного мозга, созданные с помощью этого протокола были проверены с использованием гематоксилина и эозин окрашивания на раненых и фиктивных аксолотлов. Для подтверждения регенерации, гистологические разделы были подготовлены девять недель после травмы. На снимках показана восстановленная связь спинного мозга у пострадавших животных.
Травмы и регенерации мы также следуют изучения неврологических функций. Реакция животного на стимуляцию хвоста была забита с более высокими баллами, указывающими на более высокие тактильные и ноцицептивные сенсорные функции. Среди раненых животных, была потеря неврологической функции три недели после травмы, и постепенное восстановление в течение девяти недель.
Травма спинного мозга была также визуализирована с помощью ультразвуковой графической визуализации, которая позволила визуализировать спинную артерию в качестве маркера целостности сосуда. Мрт на Хи-поле было проведено сразу после травмы и в три, шесть и девять недель. Эти сканы смогли визуализировать отек и восстановление целостности спинного мозга.
Сканирование сразу же после травмы, были склонны к шуму. Пациент и тщательная операция проложат путь к успешному результату после ламинэктомии без преждевременного повреждения спинного мозга. После этой процедуры можно применить несколько методов in vivo, таких как визуализация и электрофизиологические методы.
