Ce protocole est le premier à introduire une lésion normalisée de type contusion dans la recherche sur la régénération de la moelle épinière axolotl. Le principal avantage de cette technique est qu’elle imite le traumatisme observé dans la clinique de tous les jours, ce qui augmente la probabilité qu’une découverte future puisse être traduite. Le dispositif de dommages de contusion peut être utilisé dans n’importe quel autre modèle petit animal des dommages de moelle épinière.
La technique chirurgicale est difficile, en particulier la laminectomie. Par conséquent, il est conseillé de former la procédure sur un grand nombre d’animaux ex vivo avant de passer à la chirurgie in vivo. Pour commencer, installez une table chirurgicale en plaçant une boîte de Pétri standard sous un microscope stéréo, au-dessus d’un tissu textile chirurgical.
Placez l’axolotl anesthésié en position couchée sur la boîte de Pétri et enveloppez-le dans des serviettes en papier pour que la queue soit exposée. Identifiez les membres postérieurs et utilisez une paire de micro ciseaux pour faire la première incision juste caudale pour eux. Faire l’incision verticale de la quille jusqu’à ce que la proéminence osseuse des processus épineux se font sentir.
Étendre la coupe latéralement, de sorte que l’incision traverse toute la largeur de la queue, et saisit les processus épineux avec des forceps pour assurer une profondeur appropriée. Puis étendre l’incision verticale d’un millimètre au-dessous du processus épineux des deux côtés. Placez l’animal d’un côté, et à partir du point ventral de l’incision verticale, faire une incision horizontale d’environ 15 millimètres pour les animaux qui sont de 10 à 20 grammes de poids.
Utilisez les ciseaux pour disséquer immédiatement à travers l’incision horizontale jusqu’à ce que la colonne vertébrale se fait sentir dans la ligne médiane. Ensuite, allumez l’animal de l’autre côté et répétez le processus. Après avoir disséqué dans le plan médial profond des deux côtés, disséquer à travers la ligne médiane pour relier les deux incisions horizontales.
Ensuite, déplacez le morceau libre de la queue et de la quille d’un côté pour exposer les processus épineux. Placez l’animal dans la position couchée avec la tête face au côté non dominant du chirurgien, et utilisez une paire de forceps pour saisir les processus épineux, juste caudal aux membres postérieurs. Appliquer un levage doux vers le haut et vers la tête de l’animal.
Placez les lames d’une paire de micro ciseaux horizontaux autour du processus et coupez-les doucement, exposant la moelle épinière. Saisissez le processus épineux caudal à celui qui vient d’être enlevé, et répétez le processus. Il est impératif que vous gardiez un ascenseur constant sur le processus épineux pour s’assurer qu’il n’inflige pas de dommages à la moelle épinière lorsqu’il est enlevé.
Si la zone exposée n’est pas assez large, utilisez deux paires de forceps pour saisir la laminée des deux côtés de la moelle épinière et les tordre latéralement avec un mouvement doux. Lors de la suppression du processus épineux, il peut être nécessaire de le faire en plusieurs étapes. Par conséquent, l’exposition de la moelle épinière peut prendre plusieurs minutes.
Pour introduire une blessure de type contusion, utilisez une boîte de Pétri pour transférer l’animal à l’unité de traumatologie et faire briller une lampe de poche sur la moelle épinière. Ensuite, placez le cylindre de l’unité de traumatologie de contusion au-dessus de la moelle épinière exposée à l’aide des micro ajusteurs, et abaissez le cylindre jusqu’à ce qu’il soit de niveau avec la laminée. Attachez la tige qui tombe à l’aimant électro et placez le cylindre d’ajustement de hauteur qui tombe désiré sur l’unité de traumatologie.
Ensuite, placez la tige qui tombe sur le cylindre, éteignez l’électroaimant pour laisser tomber la tige sur la moelle épinière exposée, et utilisez la vis d’ajustement de hauteur pour soulever la tige vers le haut. Si vous introduisez une blessure aiguë, coupez la moelle épinière dans une coupe verticale parfaite, puis répétez les coupures de deux millimètres sur le côté caudal du corps. Sentez les lames des ciseaux racler le long de la partie ventrale du canal rachidien pour vous assurer que les coupures sont complètes et soulevez le morceau de moelle épinière du canal.
Pour fermer la plaie chirurgicale, placez des sutures de nylon O à 10 points de la partie la plus caudale de l’incision horizontale fermant les plaies en une seule couche et travaillant vers la partie verticale de l’incision. Lorsqu’un angle est atteint, tourner la boîte de Pétri et suturer l’autre incision horizontale, puis régler les sutures sur les incisions verticales. Avant de mettre fin à l’anesthésie, utilisez une échographie à haute fréquence pour obtenir des images de la blessure.
Alignez la pointe du transducteur avec l’axe de longueur de l’animal et plongez-le dans la solution de benzocaïne jusqu’à ce qu’il ne se trouve qu’à quelques millimètres au-dessus de la quille derrière les membres postérieurs de l’animal. Identifier le site de la blessure et acquérir des images selon les instructions du manuscrit. Une fois terminé, remettre l’axolotl à une solution sans anesthésie en coulant la boîte de Pétri dans une eau douce de cinq centimètres de profondeur et en laissant l’animal glisser.
Les lésions de moelle épinière créées utilisant ce protocole ont été validées utilisant l’hématoxyline et la coloration d’éosine sur les axolotls blessés et faux. Pour confirmer la régénération, des sections histologiques ont été préparées neuf semaines après blessure. Les images montraient une connexion de moelle épinière rétablie chez les animaux blessés.
Les blessures et la régénération nous sont également suivies par l’examen de la fonction neurologique. La réaction de l’animal à la stimulation de la queue a été notée avec des scores plus élevés indiquant des fonctions sensorielles tactiles et nociceptives plus élevées. Parmi les animaux blessés, il y avait une perte de fonction neurologique trois semaines après blessure, et une restauration graduelle dans les neuf semaines.
Les dommages de moelle épinière ont été également visualisés utilisant la formation image graphique ultrasonique, qui a permis la visualisation de l’artère dorsale comme marqueur de l’intégrité de navire. Des balayages hi-field de MRI ont été exécutés immédiatement après blessure et à trois, six, et neuf semaines. Ces balayages ont pu visualiser l’oedème et la restauration de l’intégrité de moelle épinière.
Les scans immédiatement après la blessure, étaient sujettes au bruit. La chirurgie patiente et méticuleuse ouvrira la voie à un résultat réussi après laminectomie sans dommages prématurés à la moelle épinière. Suite à cette procédure, plusieurs méthodes in vivo peuvent être appliquées, telles que l’imagerie et les techniques électrophysiologiques.
