Questo protocollo è il primo a introdurre una lesione standardizzata di tipo contusione nella ricerca sulla rigenerazione del midollo spinale axolotl. Il vantaggio principale di questa tecnica è che imita il trauma visto nella clinica di tutti i giorni, aumentando la probabilità che una scoperta futura possa essere tradotta. Il dispositivo per lesioni da contusione può essere utilizzato in qualsiasi altro piccolo modello animale di lesione del midollo spinale.
La tecnica chirurgica è difficile, specialmente la laminectomia. Pertanto, è consigliabile addestrare la procedura su un gran numero di animali ex vivo prima di progredire nella chirurgia in vivo. Per iniziare, impostare un tavolo chirurgico posizionando una piastra di Petri standard sotto un microscopio stereo, sopra un panno tessile chirurgico.
Posizionare l'axolotl anestetizzato nella posizione prona sulla piastra di Petri e avvolgerlo in tovaglioli di carta in modo che la coda sia esposta. Identificare gli arti posteriori e utilizzare un paio di micro forbici per fare la prima incisione solo caudale per loro. Fare l'incisione verticale dalla chiglia fino a quando non si sente la prominenza ossea dei processi spinosi.
Estendere il taglio lateralmente, in modo che l'incisione attraversi l'intera larghezza della coda e afferra i processi spinosi con le forcep per garantire una corretta profondità. Quindi estendere l'incisione verticale di un millimetro sotto il processo spinoso su entrambi i lati. Posizionare l'animale su un lato e, partendo dal punto ventrale dell'incisione verticale, fare un'incisione orizzontale di circa 15 millimetri per gli animali che hanno un peso da 10 a 20 grammi.
Utilizzare le forbici per sezionare immediatamente attraverso l'incisione orizzontale fino a quando la colonna vertebrale non si sente nella linea mediana. Quindi accendi l'animale dall'altra parte e ripeti il processo. Dopo aver sezionato il piano mediale profondo da entrambi i lati, sezionare attraverso la linea mediana per collegare le due incisioni orizzontali.
Quindi, spostare il pezzo libero di coda e chiglia su un lato per esporre i processi spinosi. Posizionare l'animale nella posizione prona con la testa rivolta verso il lato non dominante del chirurgo e utilizzare un paio di forcep per afferrare i processi spinosi, solo caudale agli arti posteriori. Applicare un delicato sollevamento su e verso la testa dell'animale.
Posizionare le lame di un paio di micro forbici orizzontali attorno al processo e tagliarla delicatamente, esponendo il midollo spinale. Afferrare il processo spinoso caudale a quello appena rimosso e ripetere il processo. È imperativo mantenere un sollevamento costante sul processo spinoso per assicurarsi che non infligga danni al midollo spinale quando viene rimosso.
Se l'area esposta non è abbastanza ampia, utilizzare due paia di forcep per afferrare le laminae su entrambi i lati del midollo spinale e torcerle lateralmente con un movimento delicato. Quando si rimuove il processo spinoso, potrebbe essere necessario farlo in più passaggi. Pertanto, l'esposizione del midollo spinale può richiedere diversi minuti.
Per introdurre una lesione di tipo contusione, utilizzare una piastra di Petri per trasferire l'animale all'unità traumatosa e far brillare una torcia sul midollo spinale. Quindi, posizionare il cilindro dell'unità traumatologico di contusione sopra il midollo spinale esposto utilizzando i micro regolatori e abbassare il cilindro fino a quando non è livellato con le laminae. Attaccare l'asta di caduta all'elettromagnete e posizionare il cilindro di regolazione dell'altezza di caduta desiderato sull'unità traumatizzati.
Quindi, posizionare l'asta di caduta sul cilindro, spegnere l'elettromagnete per far cadere l'asta sul midollo spinale esposto e utilizzare la vite di regolazione dell'altezza per sollevare l'asta verso l'alto. Se si introduce una lesione acuta, tagliare il midollo spinale in un taglio verticale perfetto, quindi ripetere i tagli di due millimetri sul lato caudale del corpo. Senti le lame delle forbici raschiare lungo la parte ventrale del canale spinale per assicurarti che i tagli siano completi e sollevare il pezzo di midollo spinale dal canale.
Per chiudere la ferita chirurgica, posizionare le suture di nylon O da 10 punti dalla parte più caudale dell'incisione orizzontale chiudendo le ferite in uno strato e lavorando verso la parte verticale dell'incisione. Quando si raggiunge un angolo, ruotare la piastra di Petri e suturare l'altra incisione orizzontale, quindi impostare le suture sulle incisioni verticali. Prima di terminare l'anestesia, utilizzare un'ecografia ad alta frequenza per acquisire immagini della lesione.
Allineare la punta del trasduttore con l'asse di lunghezza dell'animale e immergerla nella soluzione di benzocaina fino a quando non è solo pochi millimetri sopra la chiglia dietro gli arti posteriori dell'animale. Identificare il sito della lesione e acquisire immagini in base alle indicazioni del manoscritto. Al termine, riportare l'axolotl in soluzione priva di anestetici immergendo la piastra di Petri in acqua dolce profonda cinque centimetri e lasciando scivolare via l'animale.
Le lesioni del midollo spinale create utilizzando questo protocollo sono state convalidate utilizzando l'ematossilina e la colorazione dell'eosina sugli asolotl feriti e fittizi. Per confermare la rigenerazione, sono state preparate sezioni istologiche nove settimane dopo l'infortunio. Le immagini mostravano una connessione del midollo spinale ripristinata negli animali feriti.
Lesioni e rigenerazione siamo anche seguiti dall'esame della funzione neurologica. La reazione dell'animale alla stimolazione della coda è stata segnata con punteggi più alti che indicano funzioni sensoriali tattili e nocicettive più elevate. Tra gli animali feriti, c'è stata una perdita della funzione neurologica tre settimane dopo la lesione e un graduale ripristino entro nove settimane.
La lesione del midollo spinale è stata anche vista utilizzando l'imaging grafico ad ultrasuoni, che ha permesso la visualizzazione dell'arteria dorsale come marcatore dell'integrità del vaso. Le scansioni della risonanza magnetica ad alta campo sono state eseguite immediatamente dopo l'infortunio e a tre, sei e nove settimane. Queste scansioni sono state in grado di visualizzare l'edema e il ripristino dell'integrità del midollo spinale.
Le scansioni immediatamente post infortunio, erano inclini al rumore. La chirurgia paziente e meticolosa aprirà la strada a un risultato positivo dopo la laminectomia senza danni prematuri al midollo spinale. Seguendo questa procedura, possono essere applicati diversi metodi in vivo, come l'imaging e le tecniche elettrofisiologiche.
