このプロトコルは、アショロテル脊髄再生研究において標準化された消耗型損傷を導入する最初のプロトコルである。この技術の主な利点は、日常の診療所で見られる外傷を模倣し、将来の発見が翻訳される可能性を高めることです。この損傷装置は脊髄損傷の他の小さい動物モデルで利用することができる。
手術技術は困難であり、特にラミネクトミーである。従って、インビボ手術に進む前に、多数の動物ex vivo上で処置を訓練することが推奨される。まず、標準的なペトリ皿をステレオ顕微鏡の下に置き、外科用繊維布の上に置いて外科用テーブルを設置します。
麻酔付きのアキソロトルをペトリ皿の上の起こりやすい位置に置き、尾が露出するようにペーパータオルで包みます。後肢を特定し、マイクロハサミを使用して、最初の切開をそれらに対して単に尾行にします。棘のプロセスの骨の目立ちが感じられるまで、キールからの垂直切開を行います。
カットを横方向に伸ばし、切開部が尾の全幅を横切り、鉗子で棘プロセスを把握し、適切な深さを確保します。次に、垂直切開を両側の棘プロセスの下に1ミリメートル伸ばします。動物を片側に置き、垂直切開の腹側から始めて、体重が10〜20グラムの動物に対して約15ミリメートルの水平切開を行います。
はさみを使用して、脊柱が正中に感じられるまで水平切開を通してすぐに解剖します。その後、動物を反対側に向け、プロセスを繰り返します。両側から深い内側面で解剖した後、正中線を通って解剖して2つの水平切開を接続する。
次に、尾とキールの自由な部分を片側に移動して、スピンプロセスを公開します。外科医の非支配的な側に向かう頭部を持つ傾向のある位置に動物を置き、鉗子のペアを使用して棘のプロセスを把握し、後肢に向かうだけです。穏やかなリフトを上にして、動物の頭に向かって適用します。
マイクロハサミの刃をプロセスの周りに水平に置き、脊髄を露出させ、穏やかに切ります。取り外したプロセスに棘プロセスを持ち、プロセスを繰り返します。脊髄を取り除いたときに損傷を与えないように、棘プロセスに一定のリフトを保つことが不可欠です。
露出した領域が十分に広くない場合は、2組の鉗子を使用して脊髄の両側の層状をつかみ、穏やかな動きで横にねじります。スピンプロセスを削除する場合、複数の手順でこれを行う必要があります。したがって、脊髄の暴露には数分かかる場合があります。
傷式の損傷を導入するには、ペトリ皿を使用して動物を外傷ユニットに移し、脊髄に懐中電灯を当てる。次に、マイクロアジャスターを使用して露出した脊髄の上に損傷外傷ユニットシリンダーを置き、ラミネアと同じレベルになるまでシリンダーを下げる。落下ロッドを電磁石に取り付け、外傷部に所望の落下高さ調整シリンダーを置きます。
次に、シリンダに落下ロッドを置き、電磁石をオフにして露出した脊髄にロッドを落とし、高さ調整ネジを使用してロッドを持ち上げます。鋭い怪我を導入した場合は、脊髄を完璧な垂直カットで切り、2ミリメートルを身体の尾側に繰り返します。切り傷が完了したことを確認するために脊柱管の腹側部分に沿って擦り傷するはさみの刃を感じ、運河から脊髄の部分を持ち上げます。
外科的創傷を閉じるには、水平切開の最も尾大部分から10点Oナイロン縫合糸を1層に閉じ、切開の垂直部分に向かって働く。角度に達したら、ペトリ皿を回し、他の水平切開を縫合し、垂直切開部に縫合糸を設定します。麻酔を終了する前に、高周波超音波を使用して傷害の画像を取得します。
トランスデューサの先端を動物の長さの軸に合わせ、動物の後肢の後ろのキールの数ミリメートル上になるまでベンゾカイン溶液に沈めます。傷害部位を特定し、原稿の指示に従って画像を取得します。終了したら、ペトリ皿を深度5センチの淡水に浸し、動物を滑らせて、アショロトルを麻酔のない溶液に戻します。
このプロトコルを使用して作成された脊髄損傷は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用して負傷および偽のaxolotlsに染色することを検証した。再生を確認するために、組織学的セクションは、損傷後9週間で調製された。画像は、負傷した動物の脊髄接続を再確立した。
傷害と再生はまた、神経学的機能を調べることに続いています。尾の刺激に対する動物の反応は、より高い触覚および忍化性感覚機能を示すより高いスコアで採点された。負傷した動物の中で、傷害後3週間で神経機能が失われ、9週間以内に徐々に回復した。
脊髄損傷はまた、超音波グラフィック画像を使用して視覚化され、血管の完全性のマーカーとしての後動脈の視覚化を可能にした。ハイフィールドMRIスキャンは、怪我の直後と3、6、および9週間で行われました。これらのスキャンは、浮腫と脊髄完全性の回復を視覚化することができた。
スキャンはすぐに怪我の後、騒音を起こしやすい。患者と細心の注意を払った手術は、脊髄に早期損傷を与えることなく、ラミトマイの後に成功した結果への道を開きます。この手順に従って、イメージングや電気生理学的手法などのインビボ法を適用できる。
