Este protocolo é o primeiro a introduzir uma lesão padronizada do tipo contusão na pesquisa de regeneração da medula espinhal axolotl. A principal vantagem dessa técnica é que ela imita o trauma visto na clínica cotidiana, aumentando a probabilidade de que um achado futuro seja capaz de ser traduzido. O dispositivo de lesão por contusão pode ser utilizado em qualquer outro pequeno modelo animal de lesão medular.
A técnica cirúrgica é difícil, especialmente a laminectomia. Portanto, é aconselhável treinar o procedimento em um grande número de animais ex vivo antes de progredir para a cirurgia in vivo. Para começar, configure uma mesa cirúrgica colocando uma placa de Petri padrão sob um microscópio estéreo, em cima de um pano têxtil cirúrgico.
Coloque o axlotl anestesiado na posição propensa na placa de Petri, e enrole-o em toalhas de papel para que a cauda seja exposta. Identifique os membros traseiros e use um par de micro tesouras para fazer a primeira incisão apenas caudal para eles. Faça a incisão vertical da quilha até que a proeminência óssea dos processos espinhosos seja sentida.
Estenda o corte lateralmente, de modo que a incisão atravessa toda a largura da cauda, e agarra os processos espinhosos com fórceps para garantir a profundidade adequada. Em seguida, estenda a incisão vertical um milímetro abaixo do processo espinhoso em ambos os lados. Coloque o animal de um lado, e partindo do ponto ventral da incisão vertical, faça uma incisão horizontal de aproximadamente 15 milímetros para animais com 10 a 20 gramas de peso.
Use a tesoura para dissecar imediatamente através da incisão horizontal até que a coluna vertebral seja sentida na linha média. Em seguida, vire o animal para o outro lado e repita o processo. Depois de dissecar no plano medial profundo de ambos os lados, disseco através da linha média para conectar as duas incisões horizontais.
Em seguida, mova o pedaço livre de cauda e quilha para um lado para expor os processos espinhosos. Coloque o animal na posição propensa com a cabeça voltada para o lado nondominante do cirurgião, e use um par de fórceps para agarrar os processos espinhosos, apenas caudal para os membros traseiros. Aplique um elevador suave para cima e em direção à cabeça do animal.
Coloque as lâminas de um par de micro tesouras horizontais ao redor do processo e corte-a suavemente, expondo a medula espinhal. Segure o processo giranso caudal ao que acabou de ser removido, e repita o processo. É imperativo que você mantenha um elevador constante no processo espinhoso para garantir que ele não inflija danos à medula espinhal quando removido.
Se a área exposta não for larga o suficiente, use dois pares de fórceps para agarrar o laminado em ambos os lados da medula espinhal e torcê-los lateralmente com um movimento suave. Ao remover o processo spinous, pode ser necessário fazer isso em várias etapas. Portanto, expor a medula espinhal pode levar vários minutos.
Para introduzir uma lesão tipo contusão, use uma placa de Petri para transferir o animal para a unidade de trauma e brilhar uma lanterna na medula espinhal. Em seguida, coloque o cilindro da unidade de trauma de contusão acima da medula espinhal exposta usando os micro ajustadores, e baixe o cilindro até que esteja nivelado com o laminado. Coloque a haste caindo no ímã eletro e coloque o cilindro de ajuste de altura de queda desejado na unidade de trauma.
Em seguida, coloque a haste caindo no cilindro, desligue o eletroímã para soltar a haste na medula espinhal exposta e use o parafuso de ajuste de altura para levantar a haste de volta. Se introduzir uma lesão aguda, corte a medula espinhal em um corte vertical perfeito, em seguida, repita os cortes de dois milímetros para o lado caudal do corpo. Sinta as lâminas da tesoura raspando ao longo da parte ventral do canal espinhal para garantir que os cortes estejam completos, e levante o pedaço da medula espinhal do canal.
Para fechar a ferida cirúrgica, coloque suturas de nylon de 10 pontos O da parte mais caudal da incisão horizontal fechando as feridas em uma camada e trabalhando em direção à parte vertical da incisão. Quando um ângulo é atingido, gire a placa de Petri e sutura a outra incisão horizontal, em seguida, coloque suturas nas incisões verticais. Antes de encerrar a anestesia, use um ultrassom de alta frequência para adquirir imagens da lesão.
Alinhe a ponta do transdutor com o eixo de comprimento do animal e submerse-a na solução de benzocaína até que esteja apenas alguns milímetros acima da quilha atrás dos membros traseiros do animal. Identifique o local do ferimento e adquira imagens de acordo com as instruções do manuscrito. Quando terminar, devolva o axolotl à solução livre de anestésicos submergindo a placa de Petri em cinco centímetros de água doce profunda e deixando o animal deslizar.
As lesões da medula espinhal criadas usando este protocolo foram validadas usando hematoxilina e manchas de eosina em axolotes feridos e sham. Para confirmar a regeneração, seções histológicas foram preparadas nove semanas após a lesão. As imagens mostraram uma conexão medular restabelecida nos animais feridos.
Lesões e regeneração também somos seguidos pelo exame da função neurológica. A reação do animal à estimulação da cauda foi pontuada com escores mais elevados indicando funções sensoriais táteis e nociceptivas mais elevadas. Entre os animais feridos, houve perda da função neurológica três semanas após a lesão, e uma restauração gradual dentro de nove semanas.
A lesão medular também foi visualizada utilizando imagens gráficas ultrassônicas, o que permitiu a visualização da artéria dorsal como um marcador de integridade do vaso. Os exames de ressonância magnética foram realizados imediatamente após a lesão e aos três, seis e nove semanas. Esses exames foram capazes de visualizar edema e restauração da integridade da medula espinhal.
Os exames imediatamente após lesões, eram propensos a ruídos. A cirurgia paciente e meticulosa abrirá caminho para um resultado bem sucedido após laminectomia sem danos prematuros à medula espinhal. Após esse procedimento, diversos métodos in vivo podem ser aplicados, como imagens e técnicas eletrofisiológicas.
