Dieses Protokoll ist das erste, das eine standardisierte Prellung des Konfusentyps in der Axolotl-Rückenmarksregenerationsforschung einführt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie das Trauma imitiert, das in der täglichen Klinik gesehen wird, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass ein zukünftiger Befund übersetzt werden kann. Die Konfusionsverletzungsvorrichtung kann in jedem anderen Kleintiermodell der Rückenmarksverletzung verwendet werden.
Die chirurgische Technik ist schwierig, vor allem die Laminektomie. Daher ist es ratsam, das Verfahren an einer großen Anzahl von Tieren ex vivo zu trainieren, bevor es zur In-vivo-Chirurgie geht. Zunächst stellen Sie einen Operationstisch auf, indem Sie eine Standard-Petrischale unter ein Stereomikroskop auf einem chirurgischen Textiltuch platzieren.
Legen Sie das anästhesierte Axolotl in die anfällige Position auf der Petrischale und wickeln Sie es in Papiertücher, so dass der Schwanz freigelegt wird. Identifizieren Sie die Hinterbeine und verwenden Sie eine Mikroschere, um den ersten Schnitt nur kaudal zu ihnen zu machen. Machen Sie den vertikalen Schnitt aus dem Kiel, bis die knöcherne Prominenz der spinösen Prozesse gefühlt wird.
Erweitern Sie den Schnitt seitlich, so dass der Schnitt die gesamte Breite des Schwanzes durchquert und die spinösen Prozesse mit Zangen erfasst, um die richtige Tiefe zu gewährleisten. Dann verlängern Sie den vertikalen Schnitt einen Millimeter unter dem Spinnprozess auf beiden Seiten. Legen Sie das Tier auf einer Seite, und beginnend vom ventralen Punkt des vertikalen Schnitt, machen Sie einen horizontalen Schnitt von etwa 15 Millimetern für Tiere, die 10 bis 20 Gramm schwer sind.
Verwenden Sie die Schere, um sofort durch den horizontalen Schnitt zu sezieren, bis die Wirbelsäule in der Mittellinie gefühlt wird. Dann drehen Sie das Tier auf die andere Seite und wiederholen Sie den Vorgang. Nach dem Sezieren in der tiefen medialen Ebene von beiden Seiten, sezieren Sie durch die Mittellinie, um die beiden horizontalen Einschnitte zu verbinden.
Dann bewegen Sie das freie Stück Schwanz und Kiel auf eine Seite, um die spinösen Prozesse zu belichten. Platzieren Sie das Tier in der anfälligen Position mit dem Kopf zur nicht dominanten Seite des Chirurgen, und verwenden Sie ein Paar Zangen, um die spinösen Prozesse zu erfassen, nur kaudal zu den Hinterbeinen. Tragen Sie einen sanften Aufzug nach oben und auf den Kopf des Tieres auf.
Legen Sie die Klingen einer Mikroschere horizontal um den Prozess und schneiden Sie sie vorsichtig, indem Sie das Rückenmark freilegen. Greifen Sie den spinösen Prozess kaudal zu dem gerade entfernten, und wiederholen Sie den Prozess. Es ist zwingend erforderlich, dass Sie einen konstanten Anstieg auf den spinalen Prozess halten, um sicherzustellen, dass es nicht Schäden am Rückenmark verursacht, wenn es entfernt wird.
Wenn der exponierte Bereich nicht breit genug ist, verwenden Sie zwei Zangenpaare, um die Laminae auf beiden Seiten des Rückenmarks zu erfassen und sie seitlich mit einer sanften Bewegung zu verdrehen. Beim Entfernen des Spinous-Prozesses kann es erforderlich sein, dies in mehreren Schritten zu tun. Daher kann die Exposition des Rückenmarks einige Minuten dauern.
Um eine Verletzung vom Typ Prellung einzuführen, verwenden Sie eine Petrischale, um das Tier auf die Traumaeinheit zu übertragen und eine Taschenlampe auf das Rückenmark zu leuchten. Legen Sie dann den Zylinder der Konfusionstraumaeinheit mit den Mikroverstellern über dem freiliegenden Rückenmark und senken Sie den Zylinder, bis er mit den Laminaen eben ist. Befestigen Sie die fallende Stange am Elektromagneten, und legen Sie den gewünschten Fallhöhenverstellzylinder auf die Traumaeinheit.
Als nächstes legen Sie die fallende Stange auf den Zylinder, schalten Sie den Elektromagneten aus, um die Stange auf das freigelegte Rückenmark zu fallen, und verwenden Sie die Höhenverstellungsschraube, um die Stange wieder nach oben zu heben. Wenn Sie eine scharfe Verletzung einführen, schneiden Sie das Rückenmark in einem perfekten vertikalen Schnitt, dann wiederholen Sie die Schnitte zwei Millimeter auf die kaudale Seite des Körpers. Spüren Sie die Klingen der Schere, die entlang des ventralen Teils des Rückenmarkskanals kratzen, um sicherzustellen, dass die Schnitte vollständig sind, und heben Sie das Stück Rückenmark aus dem Kanal.
Um die chirurgische Wunde zu schließen, legen Sie 10 Punkt O Nylon Nähte aus dem kaudalen Teil des horizontalen Schnitts, der die Wunden in einer Schicht schließt und auf den vertikalen Teil des Schnittes hinarbeitet. Wenn ein Winkel erreicht ist, drehen Sie die Petrischale und veransähen Sie den anderen horizontalen Schnitt, dann stellen Sie Nähte auf die vertikalen Schnitte. Vor der Beendigung der Anästhesie verwenden Sie einen Hochfrequenz-Ultraschall, um Bilder der Verletzung zu erfassen.
Richten Sie die Spitze des Messumformers an der Längenachse des Tieres aus und tauchen Sie sie in die Benzocainlösung ein, bis sie nur wenige Millimeter über dem Kiel hinter den Hinterbeinen des Tieres liegt. Identifizieren Sie die Verletzungsstelle und erfassen Sie Bilder gemäß den Manuskriptanweisungen. Wenn Sie fertig sind, kehren Sie das Axolotl zur anästhetischen freien Lösung zurück, indem Sie die Petrischale in fünf Zentimeter tiefes Süßwasser tauchen und das Tier abrutschen lassen.
Die mit diesem Protokoll verursachten Rückenmarksverletzungen wurden mit Hämatoxylin- und Eosinfärbung an verletzten und Schein-Axolotlen validiert. Um die Regeneration zu bestätigen, wurden neun Wochen nach der Verletzung histologische Abschnitte vorbereitet. Die Bilder zeigten eine wiederhergestellte Rückenmarksverbindung bei den verletzten Tieren.
Verletzungen und Regeneration wird uns auch die Untersuchung der neurologischen Funktion folgen. Die Reaktion des Tieres auf die Stimulation des Schwanzes wurde mit höheren Werten bewertet, die auf höhere taktile und nozizeptive sensorische Funktionen hindeuten. Unter den verletzten Tieren gab es einen Verlust der neurologischen Funktion drei Wochen nach der Verletzung, und eine allmähliche Wiederherstellung innerhalb von neun Wochen.
Die Rückenmarksverletzung wurde auch mittels Ultraschall-Grafikbildgebung visualisiert, die die Visualisierung der dorsalen Arterie als Marker der Gefäßintegrität ermöglichte. Hi-Field-MRT-Scans wurden unmittelbar nach der Verletzung und nach drei, sechs und neun Wochen durchgeführt. Diese Scans waren in der Lage, Ödeme und Wiederherstellung der Rückenmarksintegrität zu visualisieren.
Die Scans sofort nach Verletzungen, waren anfällig für Lärm. Patienten- und akribische Operationen ebnen den Weg für ein erfolgreiches Ergebnis nach der Laminektomie ohne vorzeitige Schädigung des Rückenmarks. Nach diesem Verfahren können mehrere In-vivo-Methoden angewendet werden, wie z. B. bildgebende und elektrophysiologische Verfahren.
