Этот протокол позволяет проводить углубленное исследование микросреды яичников in vitro. Предоставление пользователям возможности определять рост и развитие фолликулов, а также стероидогенез и обилие иммунных молекул. Одним из преимуществ этого метода является способность непосредственно оценивать изменения в микросреде яичников и возникающих фолликулах и оценивать уникальное взаимодействие, вызванное добавлением специфических гормонов.
Этот метод может быть использован для изучения различных репродуктивных расстройств, вызывающих остановки фолликулов. Например, синдром поликистозных яичников. Поскольку мы можем непосредственно оценить микросреду яичников in vitro, продемонстрировать процедуру будет Брук Белл, исследователь из моей лаборатории.
Используя церированные щипцы челюсти, закрепите завязь, разрежьте пополам и начните удалять наружные ломтики. Обеспечение того, чтобы от яичника отрезали не более одного-двух миллиметров глубины поверхности, чтобы не собирался продолговатый мозг. Вырежьте скальпелем три-четыре тонкие полоски коры яичников и поместите полоски в третью заполненную PBS чашку Петри.
Разрежьте полоски на мелкие квадратные кусочки от 0,5 до одного кубического миллиметра лезвием скальпеля. Используйте линейку под чашками Петри, чтобы убедиться, что кусочки имеют одинаковый размер и толщину, чтобы сделать последовательные кусочки коры яичников. Вымойте кортикальные кусочки яичников во всех трех чашках PBS и поля антибиотиков Петри, используя изогнутые щипцы для перемещения кусочков между стирками.
Переместите кусочки коры через серию промывок LB-15 и поместите их в конечную чашку Петри, заполненную LB-15. Пометьте крышку идентификатором животного и стороной яичников. Соберите четыре кусочка коры яичников на яичник и зафиксируйте их для гистологии нулевого дня и заморозьте дополнительные кусочки для очистки РНК.
Используйте оставшиеся кусочки ткани для культивирования. Подготовьте шкаф биологической безопасности для окончательного промывания тканей и подготовки культуры. Продезинфицируйте расходные материалы с 70% этанолом, прежде чем поместить их в шкаф биологической безопасности.
Переместите все кусочки коры яичников, предназначенные для культивирования, в шкаф биологической безопасности и снова вымойте их в чашке Петри, наполненной LB-15. Пипетка 350 микролитров среды Waymouth на скважину в 24 лунку тканевой культуральной пластины. Поместите вставки без покрытия в каждую лунку с помощью щипцов, следя за тем, чтобы под основанием вставки не образовывались пузырьки.
Осторожно и деликатно расположите четыре кусочка коры яичников на сетке каждой вставки, не прокалывая сетку. Инкубируют ткань при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом. Меняйте культуру коры яичников ежедневно в течение семи дней, обязательно используя предварительно подогретую среду Waymouth.
Во время смены среды используйте щипцы, чтобы осторожно поднять вставку из колодца и собрать культивируемую среду Waymouth в трубки по 0,5 миллилитра. Установите вставку обратно в лунку и добавьте 350 микролитров свежей питательной среды, распределив ее между боковой стороной вкладыша и лункой. Храните собранную среду из культуры тканей при минус 20 градусах Цельсия.
После семи дней культивирования визуализируйте кусочки коры яичников с помощью рассеченного микроскопа с прикрепленной камерой и компьютерной программой для визуализации. Зафиксируйте два кусочка коры яичников на лунку в растворе Буэна для гистологии и мгновенно заморозьте кусочки коры яичников в жидком азоте для получения РНК для кДНК. Повторите этот шаг для всех лунок с тканью, затем соберите среду с седьмого дня и сохраните ее минус 20 градусов.
Дайте кусочкам коры яичников оставаться погруженными в раствор Буэна в течение примерно 1,5 часов, затем трижды промыть их 70%-ным этанолом, сохранить ткань в 70% этаноле и очищать ее ежедневно, пока раствор не перестанет желтеть. Окрашивание гематоксилина и эозина проводили для примордиальных фолликулов, ранних первичных фолликулов, первичного фолликула, вторичного фолликула и антрального фолликула. Постановка фолликула проводилась на коре яичников, зафиксированной до и после культивирования для оценки фолликулогенеза.
Разница в морфологии, определяемая отложением коллагена, может указывать на фиброз в коре яичников от степенных или контрольных телок. Здесь показано сравнение средней площади красного положительного окрашивания picrosirius на кору яичника, заполненную между контрольными и лестничными телками. Ежедневный сбор культуральной среды был объединен в течение трех дней для оценки различной выработки стероидных гормонов с использованием радиоиммуноанализа.
Метаболиты стероидов и производство цитокинов также измеряли в культуральной среде коры яичников из одной скважины для каждого животного, объединенного в течение четырех дней культивирования. Чем дольше ткань сидит, тем сложнее с ней работать. Возможно, вам придется практиковать точные разрезы.
Этот метод используется для понимания влияния на сигнальные пути трансдукции для спасения избыточного стероидогенеза, чтобы определить влияние избыточных стероидов на выработку цитокинов и хемокина, а также определить влияние на прогрессирование или остановку фолликулов в ткани яичников.
