Этот протокол показывает два различных способа обнаружения NKG2DL на поверхности клеток AML. Этот метод обеспечивает быстрый, удобный для пользователя метод окрашивания для обнаружения всех известных и, возможно, неизвестных NKG2DL. Этот метод позволяет отделить лейкемические стволовые клетки от объемных AML-клеток, что позволяет дополнительно охарактеризовать эти клетки.
Начните с размораживания биотина и белковых пробирок NKG2D при комнатной температуре. Быстро раскрутите порошок NKG2D FC, затем добавьте 500 микролитров PBS, чтобы восстановить порошок и тщательно перемешать с помощью микропипетки P-1000. Добавьте 100 микролитров слиткового белка NKG2DL в биотиновую трубку для получения конечной концентрации 10 микрограммов на миллилитр и тщательно перемешайте раствор с микропипеткой P-100.
Чтобы разморозить клетки AML, удалите криовиал, содержащий первичный ОМЛ, из хранилища жидкого азота и немедленно поместите его на водяную баню с 37 градусами Цельсия. Осторожно перемещайте трубку вперед и назад в воде, позволяя содержимому флакона оттаивать, пока не останется только небольшой кристалл льда. Немедленно переложите размороженные клетки в среду, содержащую трубку, и промойте флакон, используя один миллилитр среды.
Центрифугирование клеток в 300 раз G в течение 10 минут и выбросьте супернатант, не нарушая гранулу. Промыть ячейки пятью миллилитрами rpmi среды, содержащей 10% FCS, и повторить центрифугирование. Повторно суспендируют ячейку гранулы с буфером окрашивания до конечной концентрации 0,5 раза 10 до седьмой клетки на миллилитр.
Затем переложите 100 микролитров клеточной суспензии на клеточную культуру 96 лунки U-нижней пластины и центрифугируют пластину в 300 раз G в течение 10 минут. Выбросьте супернатант, не нарушая гранулу. Приготовьте мастер-смесь биотинилированного белка слияния NKG2D таким образом, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 микролитров на лунку с конечной концентрацией NKG2D 10 микрограммов на миллилитр на лунку.
Добавьте приготовленную мастер-смесь и повторно суспендировать гранулы ячейки пипеткой 200 микролитр. Инкубируйте и центрифугируйте пластину, как описано в тексте рукописи. Приготовьте мастер-микс с использованием стрептавидина ПЭ так, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 микролитров.
Добавьте мастер-микс в ячейки и повторно суспендировать гранулы многоканальной пипеткой 300 микролитра. После центрифугирования пластины и выброса супернатанта используйте 300-микролитровый многоканальный микропипетку для повторного суспендирования гранул ячейки в 200 микролитрах буфера окрашивания плюс 7-AAD. Затем проанализируйте клетки с помощью устройства проточной цитометрии.
Проанализированные образцы AML положительны на CD34 и NKG2DL, но также существуют отрицательные субпопуляции, в общей сложности четыре разные популяции. Типичная стратегия гастина начинается с отбора основной популяции клеток через их FSC и SSC. Дублеты и мертвые клетки исключаются из последующего анализа.
Ворота настраиваются с помощью элементов управления FMO для обеспечения надлежащей идентификации положительных ячеек. Здесь выделены интенсивности флуоресценции клеток, положительных для CD34 по сравнению с NKG2DL. Клетки AML, которые являются положительными для CD34, показывают более низкую поверхностную экспрессию NKG2DL, что указывает на то, что экспрессия NKG2DL связана с отсутствием стволовости.
Три первичных образца AML продемонстрировали 19,8, 49,8 и 89,4% положительных событий для окрашивания белка слияния по сравнению с 20,4, 50,4 и 90,6% для объединенного окрашивания антителом против NKG2DL. С другой стороны, окрашивание одним лигандом показало диапазон положительных событий до 92%, причем проценты варьировались в зависимости от лиганда. При попытке этого метода очень важно быть быстрым при размораживании первичных клеток AML, потому что они хрупкие и могут легко умереть на этом этапе.
После выполнения этого протокола можно выполнить сортировку клеток на основе сигнала NKG2DL для дальнейшего исследования популяций.
