Этот протокол описывает методы, которые могут быть использованы физиологами мелких животных для выяснения роли нейропептидов и других гормональных факторов, которые регулируют пищеварительную и / или выделительную систему. Эти методы позволяют измерять микроразмерные биологические образцы, которые в противном случае были бы невозможны с использованием методов, разработанных специально для более крупных моделей животных, включая, например, грызунов и телеусов. Этот метод может дать представление об эндокринной регуляции кишечника, включая транспортировку эпителиальных, а также гладких мышц, связанных с желудочно-кишечным трактом у насекомых и у видов, не являющихся насекомыми аналогичного размера.
Демонстрацию процедур почечной трубы насекомых продемонстрирует Фарва Саджади, кандидат наук из моей лаборатории. Кроме того, бывший аспирант из моей лаборатории Арьян Ладжеварди будет демонстрировать протоколы, ориентированные на заднюю кишку. Начните с приготовления блюд Рамзи и анализа сокращения для экспериментов.
Используйте пипетку и заполняйте колодцы до 20 микролитров раствора. Для нестимулированного контроля заполните скважины 20 микролитрами соленой среды Шнайдера Aedes. После того, как все скважины заполнены, налейте гидратированное минеральное масло в пробирную посуду до тех пор, пока колодцы и штифты Minutien не будут погружены.
После погружения канальца в колодец поднимите проксимальный конец канальца щипцами, извлеките его из капельки для купания и оберните конец вокруг штифта. Обмотайте каналец вокруг штифта дважды, сохраняя длину трубочки, оставшейся в капле для купания, в соответствии с другими канальцами. Чтобы сделать селективный микроэлектрод натрия, используйте шприц в один миллилитр для засыпки электрода 100 миллимолярным хлоридом натрия.
Убедитесь, что раствор для засыпки заполнен до конца электрода. При появлении пузырьков воздуха осторожно проведите микроэлектродом или извлеките раствор и заправьте. Окуните 10-микролитровый наконечник пипетки в раствор селективного ионофора натрия.
Выровняйте электрод перпендикулярно пипетке, затем поместите палец в перчатке на нижнюю часть кончика, чтобы создать давление и изгнать небольшую каплю ионофора. Осторожно прикосните каплю ионофора к кончику микроэлектрода, следя за тем, чтобы не сломать его. Заполните небольшой стакан наполовину 100 миллимолярным хлоридом натрия и поместите немного моделирующей глины на внутреннюю часть в верхней части стакана.
После того, как ионофор был взят, поместите наконечник электрода вниз на стенку стакана, впустив наконечники внутрь хлорида натрия. Храните ISME в стакане до тех пор, пока он не будет готов к использованию. Чтобы сделать электрод сравнения ISME, засыпьте электрод 500 миллимолярами хлорида калия и храните его в стакане.
Обложите наконечники электродов раствором примерно 3,5% поливинилхлорида, растворенного в тетрагидрофуране, чтобы избежать смещения ионофора при погружении в парафиновое масло. Чтобы откалибровать натриевый электрод, поместите 10 микролитровых капель стандартных концентраций хлорида натрия на край чашки Рамси с инкубированными мальпигиевыми канальцами. Поместите стандартные капли на расстоянии двух сантиметров друг от друга с более высокой концентрацией сверху.
Вставьте как электрод сравнения, так и ионселективный электрод поверх хлоридно-серебряных проводов и надежно скрепите их с помощью держателей электродов, которые прикреплены к микроманипуляторам. Направьте оба электрода к 200-миллимолярной капле хлорида натрия с помощью микроманипуляторов, следя за тем, чтобы электрокончики не касались дна тарелки. Включите электрометр, чтобы начать запись и стабилизировать показания.
Запишите чтение и перейдите к следующему стандарту. После получения измерений скорости секреции жидкости осторожно переместите эталонные и ионселективные электроды в секретируемую каплю с помощью микроманипуляторов. Включите запись и дайте показаниям стабилизироваться, а затем запишите.
Включите ионный/полярографический усилитель IPA-2, световой микроскоп и компьютеры. Поместите селективный микроэлектрод натрия на держатель, состоящий из проволоки хлорида серебра, и прикрепите его к гнезду разъема. Извлеките один опорный электрод из стакана с хлоридом калия, поместив один палец на один конец и наклонив стеклянный капилляр в сторону этого пальца, чтобы предотвратить выпадение агара.
Осторожно поместите один конец в держатель, следя за тем, чтобы не образовались пузырьки. Если есть пузырь, снимите опорный электрод, наполните держатель тремя молярными хлоридами калия и повторите. Поместите держатель электрода в гнездо разъема.
После калибровки рассекают орган. Поместите поли-L-лизиновую тарелку с рассеченным образцом на ступень микроскопа и вставьте наконечник эталонного электрода внутрь физиологического раствора. Погрузите наконечник ионселективного микроэлектрода в физиологический раствор, следя за тем, чтобы не сломать наконечник.
Используйте ручные регуляторы для регулировки положения микроэлектрода во время просмотра под световым микроскопом. Отрегулируйте вертикальное положение микроэлектрода таким образом, чтобы его кончик находился на той же плоскости, что и орган или ткань, затем включите переключатель двигателя. С помощью клавиш со стрелками компьютера переместите микроэлектрод горизонтально в положение, находящееся на расстоянии трех миллиметров от ткани, чтобы измерить фоновые записи.
Когда будете готовы, начните запись, нажав клавишу F5, получите пять измерений фоновой активности. Переместите кончик микроэлектрода близко к ткани, заботясь о том, чтобы не проткнуть орган. Уменьшите чувствительность нажатия клавиши, чтобы поместить наконечник микроэлектрода на два микрометра непосредственно вправо, перпендикулярно ткани.
Получите три записи на участке вдоль ректальной прокладки, чтобы определить место наибольшей активности ионов, а затем получить исходные измерения физиологического раствора на участке, проявляющем наибольшую активность. Чтобы зафиксировать сокращения задней кишки, заполните одну из лунок в блюде известным объемом физиологического раствора Aedes. После рассечения аккуратно переложите рассеченную заднюю кишку, прикрепленную к средней кишке, в колодец в другой посуде, следя за тем, чтобы не защемить подвздошную кишку.
Погрузите кишечник в физиологический раствор внутри колодца и поместите штифты Minutien в среднюю часть кишечника и прямую кишку. Подвздошная кишка не должна находиться под напряжением и должны наблюдаться самопроизвольные сокращения, возникающие у пилорического клапана в передней подвздошной кишке. Подключите видеокамеру к стереоскопическому микроскопу.
Затем поместите блюдо, содержащее рассеченный орган, под микроскоп и запишите видео в течение двух минут. Применение DH31 против нестимулированных мальпигиевых канальцев приводит к значительному увеличению скорости секреции жидкости, подтверждая его роль в качестве мочегонного гормона у комаров Aedes. При обработке канальцев AedaeCAPA-1 наблюдается снижение скорости секреции в dh31 стимулированных мальпигиевскими канальцами.
Ионселективные электроды использовали для измерения концентраций натрия в секретируемых каплях. Лечение DH31 на МТ не влияло на концентрацию натрия в секретируемой капле. Однако при применении AedaeCAPA-1 концентрация натрия в секретируемой жидкости была значительно увеличена.
Кроме того, по сравнению с нестимулированным контролем, DH31 привел к значительно большей скорости переноса натрия, тогда как AedaeCAPA-1 отменил это увеличение канальцев, стимулируемых DH31. SIET использовался для оценки изменений в транспорте натрия вдоль эпителия ректальной прокладки взрослых самок комаров. Аналог лейкокинина был использован для изучения изменений в абсорбции натрия, что привело к четырехкратному снижению абсорбции натрия по сравнению с контролем физиологического раствора.
Для оценки роли нейропептида пирокинина2 на подвижность подвздошной кишки был использован аналог Rhodnius prolixus, который, как было ранее показано, активирует рецептор A.aegypti PK2, обогащенный в подвздошной кишки комара. По сравнению с исходными уровнями PK2 значительно ингибирует сокращения подвздошной кишки. При выполнении анализа Рамзая с мальпигианскими канальцами и измерении скорости секреции ионов или жидкости крайне важно, чтобы канальцы не были повреждены во время рассечения или во время переноса в пробную чашку.
Следуя анализу Рамзи, специфические мембранные транспортеры могут быть нацелены либо фармакологически, либо молекулярно с использованием обратных генетических методов, чтобы определить их конкретный вклад в трансэпителиальный транспорт растворенных веществ в простом эпителии.
