Этот протокол обеспечивает доклинический подход к обнаружению и валидации фармацевтических методов лечения метаболических заболеваний сетчатки непосредственно в тканях сетчатки человека. Этот метод сочетает в себе сложность метаболизма в тканях человека с универсальностью и пропускной способностью клеточной культуры. Мы использовали этот анализ для получения доклинических данных для лечения дегенеративного заболевания сетчатки, MacTel, с использованием распространенного и безопасного препарата, изменяющего липиды, фенофибрата, который в настоящее время находится в клинических испытаниях безопасности.
Этот подход может быть применен к любому количеству распространенных стрессоров сетчатки, которые приводят к заболеванию, включая дефицит питательных веществ, гипоксию, световую токсичность и другие токсичные липиды. На 24-й неделе культуры проверьте органоиды на предмет образования рудиментарных сегментов на внешней стороне органоида. К 26-28 неделе внешние сегменты должны образовать толстый слой.
Когда можно наблюдать утолщенный сегмент сомневающегося, разбавьте один миллимолярный исходный раствор дезоксиСА до 0,51. Одна и две микромолярные концентрации в трех миллилитрах среды дифференцировки сетчатки плюс. Используя диссекционный микроскоп и стерильный зонд, выберите четыре группы органоидов примерно одинакового размера и формы с минимум пятью органоидами в каждой группе и разделите группы на отдельные лунки со сверхнизкой прикрепленностью 6-луночной пластины.
Когда все органоиды будут собраны, удалите как можно больше среды из каждой лунки и добавьте одну концентрацию раствора дезоксиСА в каждую лунку. Добавьте управление транспортным средством к четвертой группе органоидов. После двух дней культивирования замените надосадочные жидкости на соответствующий свежий дезоксиСА или контрольное разведение.
После четырех дней культивирования встройте криосекцию и окрасьте органоиды в соответствии со стандартными протоколами, чтобы можно было оценить гибель клеток в каждой культуре. После окрашивания используйте пяти-10-кратное увеличение, чтобы найти область нарезанного среза органоида, которая не повреждена, хорошо сформирована и находится в плоскости, которая отбирает репрезентативное поперечное сечение органоида. Срез должен иметь отчетливый внешний ядерный слой фоторецепторов, толщиной не менее нескольких клеток, и отдельный и отчетливый слой ядер, которые не имеют восстановления и окрашивания.
Кадрируйте изображение и увеличьте увеличение до 20x. Затем снова поместите слайд в рамку, чтобы заполнить изображение как можно большей частью фоторецепторного слоя. Установите плоскость Z и установите нижние границы нижнего предела Z-диапазона, чтобы получить изображение всей глубины среза.
Затем сфотографируйте все три канала флуорофора в Z-стеке и сохраните изображение в формате файла, который сохраняет соотношение площади на пиксель. Чтобы количественно оценить количество мертвых клеток в каждом образце, откройте стеки изображений на Фиджи. В окне параметров импорта формата bio убедитесь, что в разделе «Разделение на отдельные окна» не установлены флажки, и выберите «Изображение», «Стеки» и «Проект Z», чтобы создать новое изображение для количественной оценки.
Выберите канал изображения, который показывает восстановление и окрашивание, и используйте инструмент выделения многоугольника, чтобы очертить непрерывную область фоторецепторов на изображении. Нажмите кнопку «Анализ и установка измерений» и установите флажок «Площадь». Нажмите «Анализ и измерение», чтобы измерить площадь фоторецепторов, чтобы подсчитать умирающие клетки.
Измерение появится во всплывающем окне. Чтобы подсчитать положительные ядра апоптоза в выбранной области фоторецепторов, щелкните правой кнопкой мыши инструмент «Точка», чтобы выбрать многоточечный инструмент и выбрать положительное окрашивание апоптоза, которое перекрывается с положительными ядрами DAPI, и восстановление и окрашивание. Переключайтесь между каналами для проверки положительных клеток.
Затем разделите количество клеток, положительных для апоптоза, на площадь, чтобы получить нормализованное значение гибели клеток в фоторецепторах на органоид. После определения концентрации дезоксиСА, которая индуцирует гибель клетки-мишени, используйте стерильный зонд, чтобы выбрать три группы органоидов примерно одинакового размера и формы с минимум пятью органоидами в группе. И добавляем группы к отдельным лункам сверхнизкой присадки 6-луночной пластины.
Добавьте целевую концентрацию гибели клеток deoxySA, целевую концентрацию гибели клеток deoxySA, дополненную интересующим лекарственным средством или контрольной средой, в соответствующую лунку или органоиды. Через двое суток замените надосадочную жидкость в каждой лунке соответствующей концентрацией свежей обработочной или контрольной среды. После четырех дней культивирования оцените культуры на гибель клеток, как показано.
В этом репрезентативном анализе органоиды сетчатки, полученные из немакулярной телеангиэктазии типа 2, индуцированной индуцированной плюрипотентной линией стволовых клеток, обрабатывали четырьмя концентрациями дезоксиСА. Гибель клеток в ответ на дезоксиСА зависела от концентрации и обнаруживалась всего в 50 наномолярных дезоксиСА. Самая высокая протестированная концентрация вызывала устойчивую гибель клеток, сохраняя при этом целостность органоида сетчатки.
Лечение 20-микромолярным фенофибратом предотвращало индуцированную дезоксиСА токсичность в фоторецепторах органоидов сетчатки, значительно снижая гибель клеток примерно на 80% после четырех дней лечения. Не забудьте выбрать хорошо сформированные и здоровые органоиды, чтобы убедиться, что анализ проводится в клетках сетчатки. Органоиды могут быть обработаны для сбора РНК для количественной оценки экспрессии генов, что позволяет оценивать сигналы стресса и проверять токсические эффекты и спасения.
Используя этот метод, мы смогли проанализировать последующий метаболизм нескольких различных липидов в органоидах, открыв изучение липидного обмена в сетчатке человека.
