Этот протокол описывает, как метод зажима пластыря может быть использован для изучения термогенной способности митохондрий путем непосредственного измерения утечки митохондриального протона через внутреннюю митохондриальную мембрану. Прямое измерение протонного тока через внутреннюю митохондриальную мембрану помогает идентифицировать и точно охарактеризовать молекулярные механизмы, ответственные за митохондриальный термогенез. Этот метод позволяет не только измерить протонный ток через внутреннюю митохондриальную мембрану, но и изучить другие проводки, важные для функции митохондрий, такие как кальций или метаболиты, такие как нуклеотиды аденина.
Поместите усыпленную мышь на спину и распылите спирт, чтобы очистить и намочить волосы. Затем делают двухсантиметровый разрез на грудной клетке. Захватив кожу пинцетом, рассекните сердце от груди животного и промойте его, чтобы удалить всю кровь в 10-миллилитровый стакан с пятью миллилитрами раствора холодной изоляции.
Как только сердце будет очищено от следов крови, перенесите его на другой 10-миллилитровый стакан, содержащий пять миллилитров буфера холодной изоляции, и измельчите его на тонкие кусочки. Затем переложите его на охлажденный льдом 10-миллилитровый стеклянный гомогенизатор. Используйте верхнюю мешалку для гомогенизации предварительно нарезанной ткани на льду шестью мягкими ударами с контролируемой скоростью 275 оборотов в минуту.
Переложите гомогенат в 15-миллилитровую ледяную коническую трубку и центрифугируйте его в 700 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в гранулы ядер и неразрывных клеток. Соберите супернатант в свежую 15-миллилитровую трубку и положите на лед. Центрифугируйте супернатант в 8, 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить гранулу, содержащую митохондрии.
Повторно суспендировать митохондриальную гранулу в 3,8 миллилитрах ледяного гипертонического маннитолового буфера и инкубировать митохондриальную суспензию на льду в течение 10-15 минут. Заполните митохондриальную гипертоническую суспензию маннитола в охлажденную мини-напорную ячейку французского пресса. Затем поместите ячейку на французский пресс.
Затем выберите низкий режим французского пресса и сожмите суспензию через ячейку мини-давления при 110 на циферблате для митохондрий бурого жира и при 140 для митохондрий сердца, гарантируя, что суспензия выходит из ячейки мини-давления со скоростью около одной капли в секунду. Соберите капли в 15-миллилитровую коническую трубку, охлажденную льдом. Центрифугируйте суспензию в 10 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Повторно суспендируют гранулы митопластов в 0,5-2 миллилитрах ледяного гипертонического буфера хлористого калия и хранят суспензию на льду. Потяните боросиликатные стеклянные нити в день записи с помощью съемника микропипетки, установив программу на съемник, используемый для генерации пипеток с высокой степенью воспроизводимости. Вставьте одну стеклянную нить в съемник и потяните, чтобы получить почти две одинаковые патч-пипетки из одной боросиликатной нити.
Отрегулируйте программу, когда пипетки становятся непоследовательными между циклами вытягивания из-за старения нити нагревательной коробки съемника. Поместите пипетку внутри полировальной машины для пипетки и поместите наконечник рядом с нитью накаливания под 100-кратным увеличением, чтобы отполировать ее огнем. Нажмите ножную педаль несколько раз, чтобы нагреть нить накала, не забивая и не повреждая кривую наконечника.
Полировка до тех пор, пока пипетки не будут иметь сопротивление от 25 до 35 мегаом, получаются при заполнении раствором пипетки на основе TMA. Предварительно инкубационная крышка скользит с 0,1% желатина для уменьшения адгезии митопласта и промывает их раствором для ванны хлорида калия перед нанесением суспензии митопласта. Подготовьте сырое разведение, смешав приблизительно 35 микролитров концентрированной суспензии митопласта с 500 микролитрами раствора для ванны хлорида калия и поместите его на крышку, предварительно помещенную в колодец из четырехлуночной пластины.
Насиживайте на льду в течение 15-20 минут, чтобы митопласты отстояли вниз по покровному скольжению. Заполните камеру ванны полностью примерно 50 микролитрами раствора для ванны хлорида калия и переложите крышку с митопластами внутри камеры с помощью тонкого микродиссекционного пинцета с изогнутым наконечником. Расположите крышку в нижней части камеры без перфузии камеры, чтобы митопласты оставались стабильными на крышке.
Выберите индивидуальный неадгезивный митопласт, отсканировав крышку под микроскопом с объективом 60X. Загрузите пипетку раствором пипетки и поместите ее в держатель пипетки. Внесите пипетку в раствор ванны с помощью микроманипулятора и переместите ее чуть выше выбранного митопласта, чтобы приблизиться к ИММ.
Удерживайте мембранный потенциал на уровне нуля милливольт и применяйте импульсы 10 милливольт с помощью команды мембранного теста в программе усилителя. Примените небольшое отрицательное давление, чтобы быстро создать гигасеал с IMM. Поднимите пипетку с прикрепленным митопластом, чтобы держать их подальше от скольжения крышки, чтобы избежать поломки уплотнения из-за дрейфа пипетки во время эксперимента.
Компенсируйте блуждающие емкостные переходные процессы с помощью команды мембранного теста в программе усилителя перед тестированием конфигурации всего митопласта для получения правильного измерения емкости для мембраны митопласта после взлома. Примените кратковременные импульсы напряжения с помощью программы усилителя, чтобы разорвать мембранный пластырь под стеклянной пипеткой и достичь конфигурации всего митопласта. После обкатки установите емкостные переходные процессы с опцией мембранного теста программы усилителя для оценки емкости мембраны и ее сопротивления доступу.
Сразу после обкатки замените раствор для ванны хлорида калия раствором для ванны HEPES посредством перфузии. Примените 850-миллисекундный протокол рампы с программой усилителя. Применение протокола рампы напряжения индуцирует протонный ток с большой амплитудой через ИММ бурого жира без добавления экзогенных жирных кислот, необходимых активаторов УКП.
После перфузии либо ингибитором UCP1 гуанозиндифосфатом, либо 10-миллимолярным метилбетациклодекстрином для экстракции эндогенной мембраны жирных кислот остаточный ток используется для определения амплитуды токов UCP1, которая полностью исчезает в ИММ мышей с дефицитом UCP1. В отличие от бурого жира, ИММ нежировых тканей, таких как скелетные мышцы и сердце, не развивает измеримый протонный ток сразу после взлома. Чтобы индуцировать измеримый протонный ток через AAC, важно применять раствор для ванны HEPES, содержащий от одного до двух микромоляров экзогенных жирных кислот.
Чтобы подтвердить, что измеряемый протонный ток переносится ААС, важно применять специфические ингибиторы, карбоксиатрактилозид, которые почти полностью ингибируют протонный ток, показанный в ИММ мышей с дефицитом AAC1. Постоянное, но никогда не полное ингибирование утечки протонов достигается только тогда, когда АДФ присутствует с обеих сторон мембраны для генерации активного нуклеотидного обмена через ААС. Качество препарата митопласта будет влиять на успешность в достижении конфигурации всего митопласта.
Важно его оптимизировать. Как только молекулярный механизм митохондриального термогенеза будет расчленен с помощью метода зажима пластыря, измерение потребления митохондриального кислорода продемонстрирует важность протонного тока и термогенеза в интактных митохондриях. Этот метод открывает исследователям путь к изучению всех видов проводимости, ионов и метаболитов, важных для функционирования митохондрий.
