Este protocolo descreve como a técnica de grampo de remendo pode ser usada para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias medindo diretamente o vazamento de prótons mitocondriais através da membrana mitocondrial interna. A medição direta da corrente de próton através da membrana mitocondrial interna ajuda a identificar e caracterizar precisamente os mecanismos moleculares responsáveis pela termogênese mitocondrial. Esta técnica permite não apenas medir a corrente de prótons através da membrana mitocondrial interna, mas também estudar outras condutas importantes para a função mitocondrial, como cálcio ou metabólitos como nucleotídeos de adenina.
Posicione o rato eutanizado nas costas e pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo. Então, faça uma incisão de dois centímetros no tórax. Depois de agarrar a pele com pinças, disseque o coração do peito do animal e enxágue-o para remover todo o sangue em um béquer de 10 mililitros com cinco mililitros de solução de isolamento frio.
Uma vez que o coração tenha sido limpo de vestígios de sangue, transfira-o para outro béquer de 10 mililitros contendo cinco mililitros de tampão de isolamento frio e corte-o em pedaços finos. Em seguida, transfira para um homogeneizador de vidro de 10 mililitros refrigerados no gelo. Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações por minuto.
Transfira o homogene de homogeneização para um tubo cônico gelado de 15 mililitros e centrifuá-lo a 700 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para pelotar os núcleos e células ininterruptas. Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mililitros e coloque-o no gelo. Centrifugar o supernante a 8.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para obter uma pelota contendo as mitocôndrias.
Resuspend a pelota mitocondrial em 3,8 mililitros de tampão de mannitol hipertônico frio e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10 a 15 minutos. Preencha a suspensão de manitol hipertônico mitocondrial em uma célula de mini-pressão refrigerada da imprensa francesa. Então, coloque a célula na imprensa francesa.
Em seguida, selecione o modo baixo da prensa francesa e comprima a suspensão através da célula de mini-pressão a 110 no mostrador para as mitocôndrias de gordura marrom, e a 140 para as mitocôndrias cardíacas, garantindo que a suspensão saia da célula de mini-pressão a uma taxa de cerca de uma gota por segundo. Colete as gotas em um tubo cônico refrigerado por gelo de 15 mililitros. Centrifugar a suspensão a 10,500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Resuspenda a pelota mitoplasta em 0,5 a 2 mililitros de tampão de cloreto de potássio hipertônico frio e armazene a suspensão no gelo. Puxe os filamentos de vidro borossilicato no dia da gravação usando um puxador de micropipette, definindo um programa no puxador usado para gerar pipetas com alto grau de reprodutibilidade. Insira um filamento de vidro dentro do puxador e puxe para obter quase duas pipetas de remendo idênticas de um filamento borossilicato.
Ajuste o programa quando as pipetas se tornarem inconsistentes entre os ciclos de puxar devido ao envelhecimento do filamento da caixa de aquecimento do puxador. Posicione a pipeta dentro do polidor de pipeta e coloque a ponta perto do filamento sob a ampliação de 100X para acioná-la. Pressione o pedal do pé várias vezes para aquecer o filamento sem entupir ou danificar a curva da ponta.
Polonês até que as pipetas tenham uma resistência entre 25 e 35 megaohms são obtidos quando preenchidos com solução de pipeta baseada em TMA. A cobertura pré-incubada desliza com 0,1% de gelatina para reduzir a adesão mitoplastia e enxágüá-las com a solução de banho de cloreto de potássio antes de depositar a suspensão mitoplasta. Prepare uma diluição bruta misturando aproximadamente 35 microliters da suspensão mitoplastia concentrada com 500 microliters da solução de banho de cloreto de potássio e coloque-o nos deslizamentos de cobertura previamente colocados em um poço de uma placa de quatro poços.
Incubar no gelo por 15 a 20 minutos para mitoplastos sedimentarem o deslizamento da tampa. Encha completamente a câmara de banho com aproximadamente 50 microlitres da solução de banho de cloreto de potássio e transfira um deslizamento de cobertura com mitoplastos dentro da câmara usando pinças finas de microdisseção com uma ponta dobrada. Disponha o deslizamento de cobertura na parte inferior da câmara sem perfumar a câmara para manter os mitoplastos estáveis no deslizamento de cobertura.
Escolha um mitoplastia não adesiva individual escaneando o deslizamento da tampa sob o microscópio com um objetivo de 60X. Carregue a pipeta com a solução de pipeta e coloque-a no porta-pipetas. Leve a pipeta para a solução de banho com um micromanipulador e mova-a logo acima do mitoplasto selecionado para chegar perto do IMM.
Segure o potencial da membrana em zero milvolts e aplique 10 pulsos de milívola usando o comando de teste de membrana no programa do amplificador. Aplique uma leve pressão negativa para criar rapidamente um gigaseal com o IMM. Levante a pipeta com o mitoplasto anexado para mantê-los longe do deslizamento da tampa para evitar a quebra da vedação devido à deriva da pipeta durante o experimento.
Compense os transitórios de capacitância desviada com o comando de teste de membrana no programa do amplificador antes de testar a configuração de mitoplasto completo para obter uma medição correta de capacitância para a membrana mitoplasta após a invasão. Aplique pulsos de tensão de curta duração com o programa do amplificador para romper o patch de membrana sob a pipeta de vidro e alcançar a configuração de mitoplasto inteiro. Após a invasão, encaixe os transitórios de capacitância com a opção de teste de membrana do programa do amplificador para avaliar a capacitância da membrana e sua resistência ao acesso.
Imediatamente após a invasão, substitua a solução de banho de cloreto de potássio por uma solução de banho HEPES por perfusão. Aplique um protocolo de rampa de 850 milissegundos com o programa do amplificador. A aplicação do protocolo de rampa de tensão induz uma corrente de próton de grande amplitude em toda a IMM de gordura marrom sem a adição de ácidos graxos exógenos, os ativadores necessários de UCPs.
Após a perfusão pelo inibidor ucp1 difosfato de guanosina ou ciclodextrina beta de 10 milimolar para a extração de ácido graxo de membrana endógena, a corrente residual é usada para determinar a amplitude das correntes UCP1, que desaparece completamente no IMM de camundongos deficientes ucp1. Ao contrário da gordura marrom, o IMM de tecidos não adiposos, como músculo esquelético e coração, não desenvolve uma corrente de próton mensurável imediatamente após a invasão. Para induzir uma corrente de próton mensurável através da AAC, é essencial aplicar a solução de banho HEPES contendo um a dois micromolar de ácidos graxos exógenos.
Para confirmar que a corrente de próton medido é transportada pela AAC, é importante aplicar inibidores específicos, carboxyatractyloside, que quase inibem completamente a corrente de prótons mostrada no IMM de camundongos deficientes AAC1. Uma inibição constante, mas nunca completa do vazamento de prótons, só é alcançada quando a ADP está presente em ambos os lados da membrana para gerar uma troca ativa de nucleotídeos via AAC. A qualidade da preparação do mitoplast influenciará a taxa de sucesso na obtenção da configuração de mitoplasto.
É essencial otimizá-lo. Uma vez que o mecanismo molecular da termogênese mitocondrial é dissecado com a técnica de grampo de remendo, a medição do consumo mitocondrial de oxigênio demonstrará a importância da corrente de prótons e da termogênese em mitocôndrias intactas. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem todos os tipos de condutâncias, íons e metabólitos importantes para o funcionamento das mitocôndrias.
