このプロトコルは、パッチクランプ技術を使用して、ミトコンドリア内膜を横切るミトコンドリアプロトンリークを直接測定することによって、ミトコンドリアの熱生成能力を研究する方法を説明しています。ミトコンドリア内膜を通るプロトン電流の直接測定は、ミトコンドリア熱発生の原因となる分子メカニズムを特定し、正確に特徴付けるのに役立ちます。この技術は、ミトコンドリア内膜を横切るプロトン電流を測定するだけでなく、カルシウムやアデニンヌクレオチドのような代謝産物など、ミトコンドリア機能に重要な他のコンダクタンスを研究することを可能にする。
安楽死させたマウスを背中に置き、アルコールをスプレーして髪をきれいにし、濡らします。次に、胸郭に2センチメートルの切開を行う。ピンセットで皮膚をつかんだ後、動物の胸から心臓を解剖し、それをすすぎ、5ミリリットルの冷間隔離溶液を含む10ミリリットルのビーカーにすべての血液を取り除きます。
心臓の痕跡の血液が取り除かれたら、5ミリリットルの冷間隔離バッファーを入れた別の10ミリリットルのビーカーに移し、それを細かく切り刻みます。その後、氷冷した10ミリリットルのガラスホモジナイザーに移す。オーバーヘッドスターラーを使用して、氷上のプレカット組織を毎分275回転の制御速度で6回の穏やかなストロークで均質化します。
ホモジネートを15ミリリットルの氷冷円錐管に移し、それを摂氏4度で10分間700倍Gで遠心分離して、核および未切断の細胞をペレット化する。新鮮な15ミリリットルのチューブに上清を集め、氷の上に置きます。上清を8で遠心分離し、4°Cで10分間Gを500倍にし、ミトコンドリアを含むペレットを得た。
ミトコンドリアペレットを3.8ミリリットルの氷冷高張マンニトール緩衝液に再懸濁し、ミトコンドリア懸濁液を氷上で10〜15分間インキュベートする。ミトコンドリア高張マンニトール懸濁液をフレンチプレスの冷蔵ミニ圧力セルに充填する。次に、セルをフレンチプレスの上に置きます。
次に、フレンチプレスの低モードを選択し、褐色脂肪ミトコンドリアの場合はダイヤル上の110、心臓ミトコンドリアの場合は140でミニ圧力セルを介して懸濁液を圧縮し、懸濁液がミニ圧力セルから毎秒約1滴の速度で出てくるようにします。15ミリリットルの氷冷円錐管に滴を集める。懸濁液を10, 500倍のGで4°Cで10分間遠心分離する。
マイトプラストペレットを0.5〜2ミリリットルの氷冷高張塩化カリウム緩衝液に再懸濁し、懸濁液を氷上に保存する。記録当日にマイクロピペットプーラーを用いて硼珪酸ガラスフィラメントを引っ張り、再現性の高いピペット生成に用いるプラーにプログラムを設定する。1つのガラスフィラメントをプーラー内に挿入して引っ張り、1つのホウケイ酸フィラメントからほぼ2つの同一のパッチピペットを得る。
プーラーの加熱ボックスフィラメントの経年劣化により、ピペットが引っ張りサイクル間で不整合になった場合は、プログラムを調整してください。ピペットをピペットポリッシャーの内側に置き、フィラメントの近くに先端を倍率100倍以下に置いてファイアーポリッシュします。フットペダルを数回押して、先端の曲線を詰まらせたり傷つけたりすることなくフィラメントを加熱します。
ピペットがTMAベースのピペット溶液で満たされたときに25〜35メガオームの間の抵抗を有するまでポリッシュが得られる。プレインキュベートカバーは、0.1%ゼラチンでスリップしてミトプラストの付着を減少させ、ミトプラスト懸濁液を沈着させる前に塩化カリウム浴溶液ですすいでください。約35マイクロリットルの濃縮マイトプラスト懸濁液と500マイクロリットルの塩化カリウム浴溶液を混合して生希釈液を調製し、4ウェルプレートのウェルに予め置いたカバースリップの上に置く。
氷上で15〜20分間インキュベートし、マイトプラストをカバースリップに沈降させる。約50マイクロリットルの塩化カリウム浴溶液で浴室を完全に満たし、先端が曲がった薄い微小解離ピンセットを使用して、マイトプラストを含むカバースリップをチャンバー内に移す。カバースリップをチャンバーを灌流せずにチャンバーの底部に配置して、カバースリップ上でマイトプラストを安定に保ちます。
60倍の対物レンズで顕微鏡下でカバースリップをスキャンして、個々の非粘着性マイトプラストを選択します。ピペットにピペット溶液をロードし、ピペットホルダーに入れます。マイクロマニピュレーターでピペットをバス溶液に入れ、選択したマイトプラストのすぐ上に動かしてIMMに近づきます。
膜電位をゼロミリボルトに保持し、アンププログラムの膜テストコマンドを使用して10ミリボルトのパルスを印加します。わずかな負圧を加えて、IMMでギガシールをすばやく作成します。実験中のピペットのドリフトによるシールの破損を避けるために、マイトプラストを取り付けたピペットを持ち上げてカバースリップから遠ざけてください。
ミトプラスト全体の構成をテストする前に、アンププログラムのメンブレンテストコマンドで浮遊容量トランジェントを補償し、侵入後のミトプラスト膜の正しい静電容量測定値を取得します。アンププログラムで短時間の電圧パルスを印加し、ガラスピペットの下の膜パッチを破裂させ、全体のミトプラスト構成を実現します。ブレークイン後、容量トランジェントをアンププログラムのメンブレンテストオプションに合わせ、メンブレン容量とそのアクセス抵抗を評価します。
侵入直後は、灌流により塩化カリウム浴液をHEPES浴液に交換する。アンププログラムに850ミリ秒のランププロトコルを適用します。電圧ランププロトコルの適用は、UCPの必要な活性化剤である外因性脂肪酸を添加することなく、褐色脂肪のIMMの両端に大振幅のプロトン電流を誘導する。
内因性膜脂肪酸抽出のためのUCP1阻害剤グアノシン二リン酸または10ミリモルメチルベータシクロデキストリンのいずれかによる灌流後、残留電流を使用してUCP1電流の振幅を決定し、UCP1欠損マウスのIMMにおいて完全に消失する。褐色脂肪とは異なり、骨格筋や心臓などの非脂肪組織のIMMは、侵入直後に測定可能な陽子電流を発達させない。AACを介して測定可能なプロトン電流を誘導するためには、1〜2マイクロモルの外因性脂肪酸を含むHEPES浴溶液を適用することが不可欠である。
測定されたプロトン電流がAACによって運ばれていることを確認するためには、AAC1欠損マウスのIMMに示されるプロトン電流をほぼ完全に阻害する特異的阻害剤、カルボキシアトラチロシドを適用することが重要である。プロトンリークの一定かつ決して完全な阻害は、ADPが膜の両側に存在し、AACを介して活性なヌクレオチド交換を生成する場合にのみ達成される。ミトプラスト調製物の品質は、ミトプラスト構成全体を達成する際の成功率に影響する。
最適化することが不可欠です。ミトコンドリア熱発生の分子メカニズムをパッチクランプ技術で解剖すると、ミトコンドリアの酸素消費量の測定は、無傷のミトコンドリアにおけるプロトン電流と熱発生の重要性を実証するでしょう。この技術は、研究者がミトコンドリアの機能に重要なあらゆる種類のコンダクタンス、イオン、代謝産物を探索するための道を開きます。
