Ce protocole décrit comment la technique de la pince à patch peut être utilisée pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries en mesurant directement la fuite de protons mitochondriaux à travers la membrane mitochondriale interne. La mesure directe du courant protonique à travers la membrane mitochondriale interne permet d’identifier et de caractériser avec précision les mécanismes moléculaires responsables de la thermogenèse mitochondriale. Cette technique permet non seulement de mesurer le courant protonique à travers la membrane mitochondriale interne, mais aussi d’étudier d’autres conductances importantes pour la fonction mitochondriale, telles que le calcium ou les métabolites comme les nucléotides d’adénine.
Placez la souris euthanasiée sur le dos et vaporisez de l’alcool pour nettoyer et mouiller les cheveux. Ensuite, faites une incision de deux centimètres sur le thorax. Après avoir saisi la peau avec une pince à épiler, disséquez le cœur de la poitrine de l’animal et rincez-le pour enlever tout le sang dans un bécher de 10 millilitres avec cinq millilitres de solution d’isolation à froid.
Une fois que le cœur a été débarrassé des traces de sang, transférez-le dans un autre bécher de 10 millilitres contenant cinq millilitres de tampon d’isolation à froid et coupez-le en morceaux minces. Ensuite, transférez-le dans un homogénéisateur en verre de 10 millilitres refroidi à la glace. Utilisez un agitateur aérien pour homogénéiser le tissu prédécoupé sur la glace en six coups doux à une vitesse contrôlée de 275 rotations par minute.
Transférer l’homogénat dans un tube conique glacé de 15 millilitres et le centrifuger à 700 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les noyaux et les cellules ininterrompues. Recueillez le surnageant dans un tube frais de 15 millilitres et placez-le sur de la glace. Centrifuger le surnageant à 8 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir une pastille contenant les mitochondries.
Remettre en suspension la pastille mitochondriale dans 3,8 millilitres de tampon de mannitol hypertonique glacé et incuber la suspension mitochondriale sur de la glace pendant 10 à 15 minutes. Remplissez la suspension de mannitol hypertonique mitochondriale dans une mini-cellule de pression réfrigérée de la presse Français. Ensuite, placez la cellule sur le Français appuyez.
Ensuite, sélectionnez le mode bas de la Français appuyez et comprimez la suspension à travers la cellule de mini-pression à 110 sur le cadran pour les mitochondries de graisse brune et à 140 pour les mitochondries cardiaques, en veillant à ce que la suspension sorte de la cellule de mini-pression à un taux d’environ une goutte par seconde. Recueillez les gouttes dans un tube conique glacé de 15 millilitres. Centrifuger la suspension à 10 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Remettre en suspension la pastille de mitoplastes dans 0,5 à 2 millilitres de tampon de chlorure de potassium hypertonique glacé et stocker la suspension sur de la glace. Tirez les filaments de verre borosilicate le jour de l’enregistrement à l’aide d’un extracteur de micropipette, en réglant un programme sur le extracteur utilisé pour générer des pipettes avec un haut degré de reproductibilité. Insérez un filament de verre dans l’extracteur et tirez pour obtenir presque deux pipettes de patch identiques à partir d’un filament borosilicate.
Ajustez le programme lorsque les pipettes deviennent incohérentes entre les cycles de traction en raison du vieillissement du filament de la boîte chauffante de l’extracteur. Placez la pipette à l’intérieur de la polisseuse à pipette et placez la pointe près du filament sous un grossissement de 100X pour le polir au feu. Appuyez plusieurs fois sur la pédale pour chauffer le filament sans obstruer ou endommager la courbe de pointe.
Le polissage jusqu’à ce que les pipettes aient une résistance comprise entre 25 et 35 mégaohms est obtenu lorsqu’il est rempli d’une solution de pipette à base de TMA. Pré-incuber les couvercles avec 0,1% de gélatine pour réduire l’adhérence du mitoplast et les rincer avec la solution de bain de chlorure de potassium avant de déposer la suspension de mitoplast. Préparer une dilution brute en mélangeant environ 35 microlitres de la suspension de mitoplast concentrée avec 500 microlitres de la solution de bain de chlorure de potassium et placez-la sur les glissières de couverture préalablement placées dans un puits d’une plaque à quatre puits.
Incuber sur de la glace pendant 15 à 20 minutes pour que les mitoplastes sédimentent le long du glissement de couverture. Remplissez complètement la chambre de bain avec environ 50 microlitres de la solution de bain de chlorure de potassium et transférez un couvercle avec des mitoplastes à l’intérieur de la chambre à l’aide d’une pince à épiler à microdissection mince avec une pointe pliée. Disposez le couvercle au fond de la chambre sans infuser la chambre pour garder les mitoplastes stables sur le couvercle.
Choisissez un mitoplaste non adhésif individuel en scannant le bordereau de couverture sous le microscope avec un objectif 60X. Chargez la pipette avec la solution de pipette et placez-la dans le porte-pipette. Apportez la pipette dans la solution de bain avec un micromanipulateur et déplacez-la juste au-dessus du mitoplast sélectionné pour vous rapprocher de l’IMM.
Maintenez le potentiel de la membrane à zéro millivolts et appliquez des impulsions de 10 millivolts à l’aide de la commande de test de membrane dans le programme d’amplification. Appliquez une légère pression négative pour créer rapidement une gigaseal avec l’IMM. Soulevez la pipette avec le mitoplast attaché pour les tenir à l’écart du glissement du couvercle afin d’éviter la rupture du joint due à la dérive de la pipette pendant l’expérience.
Compenser les transitoires de capacité parasites avec la commande de test de membrane dans le programme d’amplification avant de tester la configuration de l’ensemble du mitoplast pour obtenir une mesure de capacité correcte pour la membrane mitoplast après l’effraction. Appliquez des impulsions de tension de courte durée avec le programme d’amplification pour rompre le patch membranaire sous la pipette en verre et obtenir la configuration entière du mitoplaste. Après l’effraction, équipez les transitoires de capacité avec l’option de test de membrane du programme d’amplification pour évaluer la capacité de la membrane et sa résistance d’accès.
Immédiatement après l’effraction, remplacez la solution de bain de chlorure de potassium par une solution de bain HEPES par perfusion. Appliquez un protocole de rampe de 850 millisecondes avec le programme d’amplification. L’application du protocole de rampe de tension induit un courant protonique de grande amplitude à travers l’IMM de graisse brune sans ajout d’acides gras exogènes, les activateurs requis des UCP.
Après perfusion par guanosine diphosphate, inhibiteur de l’UCP1, soit par la méthyl bêta-cyclodextrine 10 millimolaires pour l’extraction endogène des acides gras de la membrane, le courant résiduel est utilisé pour déterminer l’amplitude des courants UCP1, qui disparaît complètement dans l’IMM des souris déficientes en UCP1. Contrairement à la graisse brune, l’IMM des tissus non adipeux, tels que le muscle squelettique et le cœur, ne développe pas de courant protonique mesurable immédiatement après l’effraction. Pour induire un courant protonique mesurable par la CAA, il est essentiel d’appliquer la solution de bain HEPES contenant un à deux micromolaires d’acides gras exogènes.
Pour confirmer que le courant protonique mesuré est transporté par la CAA, il est important d’appliquer des inhibiteurs spécifiques, le carboxyatractyloside, qui inhibent presque complètement le courant protonique montré dans l’IMM des souris déficientes en AAC1. Une inhibition constante mais jamais complète de la fuite de protons n’est obtenue que lorsque l’ADP est présent des deux côtés de la membrane pour générer un échange actif de nucléotides via la CAA. La qualité de la préparation du mitoplast influencera le taux de réussite dans la réalisation de la configuration du mitoplast entier.
Il est essentiel de l’optimiser. Une fois que le mécanisme moléculaire de la thermogenèse mitochondriale est disséqué avec la technique de la pince à patch, la mesure de la consommation d’oxygène mitochondrial démontrera l’importance du courant protonique et de la thermogenèse dans les mitochondries intactes. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer toutes sortes de conductances, d’ions et de métabolites importants pour le fonctionnement des mitochondries.
